脱盐味精尾液对Na2CO3胁迫下小白菜种子萌发和幼苗生长的影响

2019-07-13李燕婷赵秉强

植物营养与肥料学报 2019年6期

许猛，袁亮，李伟，李燕婷*，赵秉强

（1 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业部植物营养与肥料重点实验室，北京 100081；2 浙江大学环境与资源学院，杭州 310058）

在盐碱土地区，盐害会严重影响种子萌发和幼苗生长，造成作物后续生育时期生长质量乃至最终产量的大幅下降[1-4]。在评价作物耐盐碱能力和筛选耐盐碱品种时种子萌发和幼苗期也是必要或决定性的阶段[4-7]。除种植耐盐碱品种外，使用有效的外源物质也是减轻盐害的重要手段[2]。作为一类生物活性物质，外源氨基酸具有调节作物生长发育、促进养分吸收利用、提高作物产量、改善作物品质、提高肥料利用率等多重增效作用[8-12]。大量研究表明[13-15]，在NaCl胁迫下外源氨基酸还能够通过抗氧化酶系统和渗透调节途径改善作物生理特性，增强叶片光合作用，促进生长发育，提高作物抗盐胁迫能力。除中性盐外，盐碱土中还存在大量的碱性盐。碱性盐(Na2CO3) 不仅会引起盐害，还会导致介质pH上升，对种子萌发和幼苗的毒害作用大于中性盐 (NaCl)[16-18]；以Na2CO3为主的苏打盐碱土在我国分布也较为广泛[19]。因此研究外源氨基酸是否能够缓解Na2CO3对作物的胁迫作用具有重要意义。

Sun等[20]研究发现外源脯氨酸能够通过渗透调节系统提高植物体内脯氨酸含量以及提高抗氧化酶活性等以缓解作物遭受的Na2CO3胁迫。外源氨基酸能够诱导抗碱胁迫响应基因的表达，提高烟草幼苗体内多种渗透调节物质含量，提高抗氧化酶活性，缓解幼苗膜脂过氧化程度，维持幼苗正常生长[21]；外源丝氨酸在碱性土上可以增加大豆根瘤数量，促进大豆植株和根系生长，提高大豆产量[22]。相对于中性盐，关于外源氨基酸在缓解作物碱性盐胁迫中的作用研究报道较少，而对混合/复合氨基酸的作用更鲜见报道。味精尾液是谷氨酸工业生产过程中产生的废液，富含多种游离氨基酸，是一种廉价易得的混合氨基酸材料[9,23]。然而味精尾液中钠离子含量较高，直接施用也会造成盐害。本文采用以味精尾液为原料经脱盐浓缩、低温干燥等专利工艺技术 (专利号：ZL201410026086.5) 制得的脱盐味精尾液制剂，研究在Na2CO3胁迫下对小白菜种子萌发和幼苗生长的影响及作用机理，为脱盐味精尾液在农业生产中，特别是盐碱土地区的推广应用提供科学依据和理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试作物：不结球白菜 (Brassica chinensisL.)，品种名上海青。

脱盐味精尾液制剂 (以下简称尾液)：采用中国农业科学院农业资源与农业区划研究所专利技术(ZL201410026086.5) 对工业味精尾液采用脱盐浓缩、低温干燥等工艺制得，其粗蛋白含量47.62%；游离氨基酸含量15.4%、谷氨酸11.6%、丙氨酸1.56%、天门冬氨酸0.49%、脯氨酸0.46%、甘氨酸0.18%、亮氨酸0.17%、色氨酸0.16%、其他氨基酸0.78%；Na+含量 1.2%；pH 3.9 (固水比为 1∶250)。

1.2 试验设计与样品测定

1.2.1 萌发试验脱盐味精尾液制剂共设置六个浓度处理：0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L。挑选整齐饱满的小白菜种子用10% NaClO消毒15 min后，用灭菌蒸馏水冲洗3次，吸去多余水分，用不同浓度尾液浸种12 h。浸种完后，再用蒸馏水冲洗3次，吸去多余水分。将浸种后的种子均匀摆入铺有2层无菌滤纸的9 cm培养皿内，分别加入5 mL含0、10、20、30 mmol/L Na2CO3的碱液后，置于25℃人工气候箱内培养。试验期间以称重法补充蒸馏水，每皿50粒，重复4次。

每天记录种子发芽数，以胚芽达到种子长度的一半以上或胚根达到种子长度为发芽。第2天计算发芽势；第4天结束试验并计算发芽率，测定胚根长、胚芽长。发芽势 (%) = 前2天总发芽数/供试种子总数 × 100；发芽率 (%) = 前4天总发芽数/供试种子总数 × 100。

1.2.2 幼苗生长发育试验采用穴盘育苗，待小白菜幼苗长到2叶1心时选择整齐一致的幼苗，移至含有1/2 Hoagland营养液中缓苗。缓苗后，分别加入浓度为0、2.5、5、10 mmol/L的Na2CO3和尾液于全Hoagland营养液中，处理浓度及各处理营养液的pH及电导率值见表1。每个处理重复3次，各重复3棵幼苗。每两天更换一次营养液。培养10天后，进行指标测定。

测定根长 (最长根)、株高、生长量 (地上部、地下部重量之和)，最大叶片SPAD值采用日本产SPAD-502叶绿素仪测定；叶片超氧化物歧化酶(SOD) 活性采用氮蓝四唑光化学还原法[24]测定，过氧化物酶 (POD) 活性采用愈创木酚法[24]测定，过氧化氢酶 (CAT) 活性采用紫外线吸收法[25]测定，所有酶活性单位以样品鲜重为基准；叶片丙二醛 (MDA) 含量采用硫代巴比妥酸法[25]，叶片超氧阴离子自由基产生速率采用羟胺氧化法[25]测定，脯氨酸 (Pro)含量采用磺基水杨酸法[26]测定。

1.3 数据处理

试验数据用Excel 2013、DPS 9.0进行统计分析，采用LSD法进行差异显著性检验。

表1 各处理营养液pH及EC值 (μS/cm)Table 1 pH and electrical conductivities (EC) of nutrient solutions after adding different amounts of tail liquid and Na2CO3

2 结果与分析

2.1 脱盐味精尾液对Na2CO3胁迫下小白菜种子萌发的影响

随着Na2CO3浓度的提高，蒸馏水浸种小白菜种子的发芽势迅速下降，严重抑制了种子的萌发。在无Na2CO3胁迫 (0 mmol/L Na2CO3) 下，尾液本身同样会抑制发芽势，且尾液浓度达到0.4 g/L时抑制作用达到显著性水平。而在10、20、30 mmol/L Na2CO3条件下，小白菜种子发芽势随尾液浓度的增加均呈先上升后下降的趋势，且均以0.1 g/L添加效果最好，与不添加尾液相比发芽势分别提高32.35%、18.87% 和 94.74% (图1)。

脱盐味精尾液可缓解Na2CO3胁迫对小白菜种子发芽的抑制作用。在不施用尾液的条件下，Na2CO3浓度越高对小白菜种子发芽的抑制作用也明显越强；在无Na2CO3条件下，尾液本身会降低种子发芽率，且浓度达到0.8 g/L时最显著。在各浓度Na2CO3条件下小白菜种子发芽率随尾液浓度增加均呈现先上升后下降的趋势，以0.1 g/L尾液效果最好，与不添加相比发芽率分别提高6.56%、14.95%和72.73%(图1)。

随Na2CO3浓度的提高，小白菜胚根长下降非常迅速，10 mmol/L Na2CO3强烈抑制了胚根的伸长。在对照 (0 mmol /L Na2CO3) 条件下，除0.8 g/L尾液处理胚根长显著下降55.41%外，其它处理与不添加相比差异不显著。在10、20、30 mmol/L Na2CO3浓度下，随尾液浓度提高，胚根长呈现先上升后下降的趋势，以0.1 g/L尾液促进胚根伸长的效果最好(图2)。

图1 不同Na2CO3胁迫下脱盐味精尾液对小白菜种子发芽势和发芽率的影响Fig.1 Germination potential and rate of pakchoi seeds under different Na2CO3and tail liquid addition levels

图2 不同Na2CO3胁迫下脱盐味精尾液对小白菜胚根长和胚芽长的影响Fig.2 Length of root and plumule of pakchoi under different Na2CO3and tail liquid addition levels

Na2CO3浓度越高，对小白菜种子胚芽长的抑制作用越强烈。在不加Na2CO3条件下，与不添加尾液相比，除0.8 g/L尾液处理胚芽长显著下降46.67%外，其它处理与不添加尾液差异均不显著。在10 mmol/L Na2CO3浓度下与不添加尾液相比，0.05 g/L尾液处理胚芽长增加9.52%，之后随着尾液浓度的升高，胚芽长呈现下降的趋势。在20 mmol/L和30 mmol/L Na2CO3胁迫下，随尾液浓度的上升，胚芽长均呈现先上升后下降的趋势，以0.1 g/L尾液效果最好 (图2)。

2.2 脱盐味精尾液对Na2CO3胁迫下小白菜幼苗生长的影响

随Na2CO3浓度的上升，不添加尾液处理的小白菜生长量呈现下降的趋势，在10 mmol/L Na2CO3条件下生长量仅为对照条件下 (0 mmol/L Na2CO3) 的56.9%，严重阻碍了幼苗的生长。在对照条件下，尾液本身同样会显著降低生长量，且随尾液浓度的增加，抑制作用增强。在不同碱浓度胁迫条件下，随尾液浓度增加，小白菜生长量均呈现先升后降的趋势：在2.5 mmol/L Na2CO3条件下，以0.05 g/L尾液的效果最好，与不添加尾液相比其生长量显著提高13.8%；而在5 mmol/L和10 mmol/L Na2CO3条件下，以0.1 g/L的效果最好，与不添加尾液相比生长量分别显著提高40.7%和32.0%；高浓度 (0.4～0.8 g/L) 尾液在各碱浓度条件下均会显著抑制小白菜的生长。在同一尾液浓度下，随Na2CO3浓度上升，鲜重均表现出先升后降的趋势 (图3)。

图3 不同Na2CO3浓度下脱盐味精尾液对小白菜鲜重的影响Fig.3 Fresh weight of pakchoi under different Na2CO3and tail liquid addition levels

随Na2CO3浓度上升，不添加尾液处理的小白菜叶片SPAD值先保持平稳，但在10 mmol/L Na2CO3条件下SPAD值迅速下降仅为对照的56.86%。在不加Na2CO3条件下，与不添加尾液相比，添加0.05 g/L尾液处理叶片SPAD值基本持平，之后随着尾液浓度的增加，SPAD值迅速下降，0.1 g/L尾液处理SPAD值即显著下降47.36%。在各碱胁迫条件下，随尾液浓度增加，SPAD值均呈现先上升后下降的趋势：在2.5 mmol/L Na2CO3条件下，以0.05 g/L尾液效果最好，与不添加相比SPAD增加13.77%，而在5 mmol/L和10 mmol/L Na2CO3条件下以0.1 g/L效果最好；高浓度 (0.2～0.8 g/L) 尾液在各碱浓度下均会明显降低SPAD值 (图4)。

图4 不同Na2CO3浓度下脱盐味精尾液对小白菜SPAD值的影响Fig.4 SPAD values of pakchoi under different Na2CO3and tail liquid addition levels

表2表明，随Na2CO3浓度的上升，不添加尾液处理株高呈现先升后降的趋势，在10 mmol/L Na2CO3条件下株高仅为对照的70.44%，表明高Na2CO3浓度会显著抑制小白菜茎的伸展。在不加Na2CO3条件下，随尾液浓度增加，株高呈现一直下降的趋势。在各碱浓度胁迫下，随尾液浓度的上升，小白菜株高呈现先升后降的趋势：在2.5、5 mmol/L Na2CO3浓度下以0.05 g/L添加量对促进株高的效果最好，与不添加处理相比株高分别增加4.22%、4.00%，但差异不显著；在10 mmol/L Na2CO3浓度下，以0.1 g/L添加量植株最高，与不添加处理相比株高显著增加17.25%。Na2CO3浓度越高对不添加尾液处理的小白菜根长抑制作用越强。在不加Na2CO3条件下尾液本身同样会抑制根的伸长，且尾液浓度越高抑制作用越强。在2.5 mmol/L Na2CO3条件下，随尾液浓度的增加，根长同样一直下降，除0.05 g/L处理外其它处理均与不添加处理达到差异显著性水平。在5、10 mmol/L Na2CO3条件下，与不添加处理相比，除0.05 g/L处理根长分别增加13.10%和8.07%外，其余尾液处理均显著抑制小白菜根的伸长。

表2 不同Na2CO3浓度下脱盐味精尾液对小白菜株高和根长的影响Table 2 Shoot and root length of pakchoi under different Na2CO3concentrations and tail liquid addition levels

2.3 脱盐味精尾液对Na2CO3胁迫下小白菜幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

随着Na2CO3浓度的上升，0 g/L尾液处理叶片超氧化物歧化酶 (SOD) 活性呈现先上升后下降的趋势，在10 mmol/L Na2CO3条件下的SOD活性为对照条件 (0 mmol/L Na2CO3) 下的78.50%，显著抑制了SOD的活性。在不加Na2CO3条件下，与不添加尾液处理相比，随着尾液浓度的上升，SOD活性呈现先升后降的趋势，SOD活性最高的0.1 g/L处理显著上升34.17%，而最低的0.8 g/L处理下降10.01%。在2.5、5、10 mmol/L Na2CO3胁迫下，小白菜叶片SOD活性随尾液浓度增加均呈现先上升后下降的趋势，以0.1 g/L尾液效果最好。

随着Na2CO3浓度的上升，0 g/L尾液处理叶片过氧化物酶 (POD) 活性呈现先上升后下降的趋势。在不加Na2CO3条件下，与不添加尾液处理相比，POD活性呈现“持平-上升-下降”的趋势，以0.2 g/L处理活性最高，显著增加43.66%。在2.5、5、10 mmol/L Na2CO3条件下，各浓度尾液能促进或保持POD活性，以0.05 g/L或0.1 g/L尾液添加效果最好 (表3)。

随Na2CO3浓度的上升，0 g/L尾液处理叶片CAT活性呈现先上升后下降的趋势。在不加Na2CO3条件下，随尾液浓度的增加，各处理小白菜叶片CAT活性也呈现先上升后下降的趋势，均高于0 g/L处理。在2.5、5、10 mmol/L Na2CO3条件下，各尾液处理均能提高或保持小白菜叶片CAT活性，0.8 g/L尾液对提高小白菜叶片CAT活性的效果最好 (表3)。

2.4 脱盐味精尾液对Na2CO3胁迫下小白菜幼苗叶片活性氧和丙二醛 (MDA) 含量的影响

高浓度Na2CO3会显著提高无尾液处理叶片的活性氧产生速率。与对照相比，10 mmo/L Na2CO3条件下产生速率提高58.71%。在不加Na2CO3条件下，与无尾液处理相比，产生速率呈现先下降后上升的趋势，0.05 g/L处理的产生速率下降10.74%，而0.2～0.8 g/L处理增幅达38.32%～69.99%。在2.5、5、10 mmol/L Na2CO3浓度下，0.05～0.2 g/L尾液会使小白菜叶片产生速率下降；而高浓度尤其是0.8 g/L尾液则会加快或保持产生速率(表4)。随Na2CO3浓度的增加，无尾液处理叶片的MDA含量呈现一直上升的趋势，与对照相比，在10 mmol/L Na2CO3条件下MDA含量显著增加达54.83%。在0～10 mmol/L Na2CO3浓度下，随尾液浓度增加，小白菜叶片MDA含量均呈现先下降后上升的趋势。在各浓度Na2CO3条件下，0.05～0.4 g/L尾液均能降低小白菜叶片MDA含量 (表4)。

表3 不同Na2CO3浓度下脱盐味精尾液对小白菜叶片抗氧化酶活性的影响Table 3 Activities of antioxidative enzymes in pakchoi leaves under different Na2CO3concentrations and tail liquid addition levels

2.5 脱盐味精尾液对Na2CO3胁迫下小白菜幼苗叶片脯氨酸含量的影响

随着Na2CO3浓度的上升，无尾液处理叶片的Pro含量呈现“下降-上升-下降”的趋势。在不加Na2CO3条件下，除0.05 g/L处理叶片的脯氨酸含量与无尾液处理相比基本持平外，其它处理均显著增加。在2.5、5、10 mmol/L Na2CO3浓度下，低浓度(0.05～0.1 g/L) 尾液脯氨酸含量与不添加处理基本持平，高浓度 (0.2～0.8 g/L) 尾液会显著增加小白菜叶片脯氨酸含量 (图5)。

3 讨论

3.1 脱盐味精尾液对Na2CO3胁迫下小白菜种子萌发的影响

Na2CO3浓度越高对小白菜种子萌发的抑制作用越强。在30 mmol/L Na2CO3浓度下胚芽突破种皮后不再伸长，而胚根则在20 mmol/L Na2CO3浓度下突破种皮后不再伸长。这说明Na2CO3对胚根的抑制作用要大于胚芽，与蔺吉祥等[18]和马红媛等[27]研究结果一致。试验发现，有的幼苗在15 mmol/L Na2CO3环境中即死亡，说明Na2CO3对小白菜幼苗的抑制作用要大于种子。这是因为种子有种皮的保护，能抵挡一定程度的逆境胁迫[18]。

外源物质浸种能够“激活”作物的耐碱能力，使作物提前适应碱性盐环境，是提高作物抗碱性的有效手段之一[28-29]。在本试验Na2CO3浓度条件下，以0.1 g/L尾液浸种处理种子萌发质量最好，可明显缓解Na2CO3对种子萌发的抑制，这可能是因为碱性盐会导致渗透胁迫和离子毒害，造成种子内部蛋白酶等代谢不正常，而尾液中的氨基酸在浸种过程中可随种子吸水作用进入种子内部，不仅可以提高种子蛋白酶、淀粉酶的活性，还可以降低细胞内的渗透势，缓解渗透胁迫，增强种子活力，从而维持正常的萌发过程[30-32]。此外，种子萌发的代谢强度与细胞质膜的完整性密切相关，外源氨基酸可以提高种子抗氧化酶活性，缓解碱性盐胁迫下活性氧累积对细胞质膜的伤害[33-34]。而尾液浓度过高 (＞ 0.4g/L) 则会加剧渗透胁迫对种子的抑制，同时尾液本身呈酸性并含有一定的盐分，浓度过高也会造成酸害和盐害，抑制种子萌发。

表4 不同Na2CO3浓度下脱盐味精尾液对小白菜叶片产生速率和丙二醛 (MDA) 含量的影响Table 4 producing rate and MDA content of pakchoi leaves under different Na2CO3and tail liquid addition levels

注（Note）：同列数值后不同字母表示同一指标相同 Na2CO3浓度下不同尾液加入量处理间差异达 0.05 显著水平 Values followed by different letters in same column represent significant differences among tail liquid treatments at the same Na2CO3concentration at the 0.05 level.

指标Index尾液用量 (g/L)Tail liquid addition Na2CO3水平 Na2CO3level (mmol/L)0 2.5 5 10产生速率producing rate[mol/(g·min)，FW]0 0.30 bc 0.28 ab 0.42 a 0.48 a 0.05 0.27 c 0.18 b 0.36 b 0.43 ab 0.1 0.34 abc 0.20 b 0.26 c 0.34 b 0.2 0.52 a 0.18 b 0.26 c 0.42 ab 0.4 0.42 abc 0.27 ab 0.40 ab 0.53 a 0.8 0.48 ab 0.38 a 0.42 a 0.52 a MDA 含量MDA content(μmol/g，FW)0 10.70 d 14.63 b 14.95 a 16.57 a 0.05 6.60e 9.64 cd 13.38 ab 9.96 c 0.1 11.90 d 8.20 d 12.05 bc 11.62 bc 0.2 15.11 c 10.15 cd 11.50 bc 10.23 c 0.4 19.64 b 12.10 bc 9.96 c 14.40 ab 0.8 25.79 a 22.61 a 11.44 bc 16.14 a

图5 不同Na2CO3浓度下脱盐味精尾液对小白菜叶片脯氨酸含量的影响Fig.5 Proline concentration of pakchoi leaves under different Na2CO3and tail liquid addition levels

3.2 脱盐味精尾液对Na2CO3胁迫下小白菜幼苗生长的影响

研究证明[35]，氨基酸在碱性环境下能被小白菜直接吸收，可提供碳、氮营养，参与植株体内的碳、氮转化，调控代谢循环，促进作物生长。在Na2CO3胁迫下，适宜浓度的尾液增强了幼苗的光合作用，促进了茎的伸展，增加了幼苗生长量，从而有效缓解了Na2CO3胁迫对小白菜幼苗的伤害。然而，脱盐味精尾液浓度过高也会影响作物生长。水培试验营养液最佳pH为5.5～6.5[36-37]，但本文所用尾液呈酸性，浓度过高则使得营养液pH下降迅速(表1)，阻碍了小白菜幼苗正常生长；同时，尾液本身也含有一定浓度的盐，用量过高也会与Na2CO3一样造成盐害。因此，在无Na2CO3条件下，随尾液浓度升高小白菜幼苗生长受到抑制，幼苗不能正常生长。在不同盐碱胁迫下应使用适宜浓度的尾液。

综上，脱盐味精尾液之所以能够缓解碱性盐胁迫，可能是由于尾液本身呈酸性能中和一部分Na2CO3的碱害，但效果表现最好的尾液处理使营养液pH值下降幅度有限 (只有0.2左右，表1)。所以，更可能的原因是尾液中甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸等多种游离氨基酸共同发挥的作用。该结果也为味精尾液的减量化和资源化利用提供了新途径。目前氨基酸营养的机理研究远远落后于市场应用，在以后的研究中，除了确定氨基酸类物质的使用量、使用时期、使用方法外，还应进一步明确其中各成分发挥的作用以及各成分之间可能存在的协同、拮抗作用，为氨基酸的进一步开发、利用提供依据。