镉胁迫下生物炭与锌/钾叶面肥促进烟草生长降低镉富集的协同效应

2019-07-13悦飞雪李继伟王艳芳

植物营养与肥料学报 2019年6期

刘领，悦飞雪，李继伟，李冬，王艳芳

（河南科技大学农学院，河南洛阳 471023）

烟草作为一种重要的经济作物，其品质提高和无公害生产一直是烟草行业研究的重点。随着人们对“吸烟与健康”的日益关注，烟叶安全性问题越来越受重视，其中烟草与重金属的关系及其调控技术研究已成为国内外烟草研究的热点之一[1]。镉是土壤中重要的重金属污染元素之一，由于其在土壤中具有较强的移动性，极易被烟草叶片吸收富集[2]。烟叶中过量的镉积累不仅会影响烟株的生长发育和产量品质[3-4]，而且在卷烟抽吸的过程中，重金属镉还会随着主流烟气进入人体，引起器官病变 (如肺气肿、肠胃病变、贫血及高血压等)，严重危害人类健康[5-6]。因此，如何采取经济有效的修复措施，减轻镉对烟株的毒害，降低烟株对重金属镉的吸收富集，显得十分必要。

近年来，由生物质热解而成的生物炭作为农用土壤改良剂、肥料缓释载体及碳封存剂已受到国内外研究学者的普遍关注。生物炭通常是由农林废弃物 (如小薪柴、农作物秸秆、杂草、粪便等) 在限氧或缺氧环境下高温裂解后的固体产物[7]。生物炭的特性 (如高度稳定性、芳香化结构、富含碳、体小多孔、比表面积大、较强的持水保肥能力等) 已在各个领域被广范研究[8]，并且在农业生产中应用表现出重要的生态功能，包括增强土壤碳汇、促进养分利用及降低环境污染等[9]。由于生物炭表面富含羧基、酚羟基、羰基、醌基等各种官能团，孔隙结构发达，并且颗粒表面带有大量负电荷，能够很好地吸附固定土壤中的重金属离子，能够降低重金属在土壤中的迁移和有效性，减少植物体对重金属的吸收积累[10-11]，已被证明在土壤污染修复治理中有着广阔的应用前景。然而，生物炭缓解植物重金属胁迫的生理生化机制及其与其它修复措施的联合应用效应仍需要进一步探究。

植物在吸收和利用金属离子时，不同金属离子之间会出现离子拮抗作用。研究表明，施用叶面肥不仅可以增加植物的抗性，促进植物生长，而且可以通过离子拮抗作用降低植物对土壤中重金属离子的吸收转运，减少植物对重金属的富集，提高作物生产的安全性[12-13]。磷酸二氢钾和硫酸锌作为烤烟生产中常用的叶面肥料具有利用效率高、吸收快等特点，可增加烟株的营养抗性，促进烟叶生长，减轻烟叶病害，提高烟叶产量和品质[14]。然而，重金属镉胁迫条件下，两种不同叶面肥对烟草生长和镉吸收的影响，以及联合土壤生物炭修复的耦合效应与机制，目前尚不十分清楚。鉴于此，本试验采用温室大棚盆栽模拟轻度镉污染胁迫的方式，分析比较了生物炭单施、锌/钾叶面肥单施及生物炭 + 锌/钾叶面肥配施对镉胁迫下烟草生长、抗氧化酶活性、土壤镉形态变化及烟株镉富集特征的影响，旨在为轻度镉污染土壤的修复利用及烟草安全生产提供施肥依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2016年在河南科技大学农场温室大棚中进行 (34°61′N，112°42′E)。供试土壤釆自河南科技大学农场0—20 cm耕层，质地为黄潮土。土壤除去石子等杂物后风干过筛备用，供试土壤pH 7.6、有机质12.32 g/kg、总氮0.84 g/kg、碱解氮46.7 mg/kg、速效磷17.1 mg/kg、速效钾106 mg/kg、全镉含量0.038 mg/kg、土壤粘粒18.8%、土壤粉粒32.2%、土壤砂粒49.0%。供试生物炭材料购自河南商丘三利新能源有限公司的小麦秸秆生物炭 (于450℃条件下小麦秸秆限氧热解制成)，基本理化性质为pH 10.4、比表面积8.92 m2/g、有机碳52.2%、全氮5.9 g/kg、全磷0.89 g/kg、全钾23.2 g/kg。供试叶面肥磷酸二氢钾和硫酸锌为优级纯配制，购自洛阳市鑫华化工市场。供试烤烟 (Nicotiana tabacumL.) 品种为‘中烟100’，由于烟草种子较小，为了保证烟苗的整齐度采用统一育苗培养至5片叶期，供盆栽试验使用。供试烟草专用复合肥由洛阳市烟草公司提供 (N∶P2O5∶K2O = 10∶12∶18)。

1.2 试验设计

试验共设6个处理：1) 对照 (不施用生物炭和叶面肥，CK)；2) 添加生物炭20 g/kg(B)；3) 叶面喷施0.5%的ZnSO4溶液 (Zn)；4) 叶面喷施0.5%的KH2PO4溶液(K)；5) 添加生物炭20 g/kg土 + 叶面喷施0.5%的ZnSO4溶液 (B + Zn)；6) 添加生物炭20 g/kg土 + 叶面喷施0.5%的KH2PO4溶液 (B + K)。将各处理土壤、烟草专用复合肥 (按纯氮 0.2 g/kg土壤计算) 及相应的生物炭混合，通过向混合土样中喷洒定量CdSO4·8H2O溶液的方法使土壤镉污染水平为3 mg/kg (依据我国土壤环境质量标准GB15618-1995，模拟轻度镉污染胁迫水平)，然后用铁锹充分掺兑均匀后，装入塑料盆中 (盆口直径22 cm、高24 cm)，每盆装土5 kg。每个处理8个重复，共计48盆，随机排列于温室大棚中。

盆栽土壤的含水量调节保持在田间持水量的60%平衡两个月后[15]，于2016年4月25日移栽烟苗，每盆检烟1株，每隔2天用称重法加入去离子水补充水分，控制土壤含水量为田间持水量的70%。烟苗移栽后30天和60天时，叶面肥处理使用小喷壶均匀喷施烟株叶片正背两面，以叶片附着一层小水滴，无水珠滴下为准，其它处理喷等量的去离子水。烟株移栽后40天选择各处理中的4个重复，选取烟株从上往下数第4片叶测定镉胁迫下烟株叶片的生理指标。烟株移栽85天后选择各处理剩余4个重复测定烟株株高，并整株收获，同时采集根际土壤样品。植株按根、茎、下部叶 (从下到上1～5片)、中部叶 (6～10片)、上部叶 (11～15片) 5部分分离，认真清洗干净后放入烘箱中，105℃杀青30 min后，70℃烘干48 h至样品恒重，称取各部分干重，并计算干物质生物量。烘干的各部分组织用粉碎机粉碎后过筛装于塑料封口袋中保存，用于测定各部位的镉含量。采集的植物根际土壤样品0.5 kg，自然风干、过筛，用于测定土壤中不同形态的镉含量。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 烟株生理指标测定丙二醛 (malondiadehyde，MDA) 和抗氧化酶活性的测定：取0.5 g新鲜叶片，加液氮充分研磨后，用2 mL 10% 三氯乙酸溶液提取丙二醛。加入2 mL含1% PVP的0.1 mol/mL磷酸缓冲液 (pH 5.5～8.8)，于4℃下13000 r/min离心20 min，所得上清液即为酶粗提液。

MDA含量测定采用硫代巴比妥酸 (TBA) 法[16]；超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD) 测定采用氮蓝四唑还原法[17]；过氧化物酶 (peroxidase，POD) 测定采用愈创木酚法[18]；过氧化氢酶 (catalase，CAT) 活性采用紫外吸收法测定[19]。

1.3.2 烟株各部位镉含量测定准确称取0.5 g各部位植物样品置于消煮管中，优级纯HNO3-HClO4(4∶1) 消煮后，采用石墨炉原子吸收分光光度法，和原子吸收光谱仪 (VARIAN AA240) 测定。

1.3.3 土壤各形态镉含量测定按照欧盟提出的BCR连续提取法[20]处理样品，分步骤提取出弱酸提取态、可还原态、可氧化态和残渣态Cd，离心过滤后得到的提取液用VARIAN AA240测定各形态的Cd含量。

1.3.4 富集系数和转运系数计算烟株镉的生物富集系数 (bio-concentration factor，BCF) 和生物转运系数 (translocation factor，TF) 计算如下[21]：

植株地上部分镉含量 (mg/kg) = 烟株地上部分所有组织镉的总积累量/地上部组织总生物量。

BCF = 植株地上部镉含量/土壤中的镉含量，富集系数越大，表示烟株积累重金属能力越强。

TF = 植株地上部镉含量/烟株根中的镉含量，转运系数越高，表示重金属从根部转运到地上的能力越强。

1.4 数据处理和分析

试验数据基础分析采用Excel 2007，处理间多重比较采用SPSS 17.0，作图采用Origin 9.0。

2 结果与分析

2.1 不同处理对烟株株高和生物量的影响

与对照相比，生物炭与叶面肥单独应用及其联合处理均显著增加了烟株的株高、地上部干重和根干重 (P＜ 0.05)。各处理对烤烟株高、地上部干重和根干重的影响表现为 B + Zn ＞ B + K ＞ Zn ＞ K ＞B ＞CK。对株高而言，B、Zn、K、B + K和B + Zn处理与CK相比均显著增加烟株株高，Zn和K处理之间无显著差异 (P＞ 0.05)；对地上部干重而言，B、Zn、K、B + K和B + Zn处理与CK相比均显著增加烟株地上部干重，B和K处理之间无显著差异；对根干重而言，B、Zn、K、B + K和B + Zn处理与CK相比均显著增加烟株根干重，B、K和Zn处理之间无显著差异。总体来看，叶面肥处理对烟株生长的效应大于生物炭处理；B + Zn和B + K处理对提高烟株株高和生物量效果较好，株高分别较对照提高52.8%和46.4%，地上部生物量分别较对照提高146.0%和108.0%，地下生物量分别较对照提高95.9%和55.4%，说明生物炭和叶面肥联合处理有利于促进烟株的生长 (表1)。

2.2 不同处理对烟株叶片MDA含量和抗氧化酶活性的影响

与CK相比，生物炭、叶面肥单独施用及其配施均显著降低烟株叶片中MDA含量 (P＜ 0.05)，各处理效应为 CK ＞ B＞ K ＞ Zn ＞ B + Zn ＞ B + K。B、Zn、K、B + K和B + Zn处理与CK相比均显著降低烟株叶片MDA含量 (P＜ 0.05)，Zn和K处理之间、B + Zn和B + K处理之间对MDA含量没有显著差异(P＞ 0.05)，其中B + K处理对降低MDA含量效果最好，其次是B + Zn处理，分别较对照降低49.4%和44.5%，说明生物炭和喷施叶面肥联合施用更有利于降低烟株叶片的MDA含量 (图1A)。

各处理对SOD、POD、CAT酶活性影响的效应表现为 B + Zn ＞ B + K ＞ Zn ＞ K ＞ B ＞ CK。B、Zn、K、B + K和B + Zn处理与CK相比均显著增加烟株叶片SOD活性 (P＜ 0.05)，Zn、K和B处理之间对提高SOD活性无显著差异 (P＞ 0.05)。B、Zn、K、B + K和B + Zn处理与CK相比均显著增加烟株叶片POD和CAT活性 (P＜ 0.05)，Zn和K处理之间、B + K和B + Zn处理之间对POD、CAT酶活性无显著差异。B + Zn处理对提高SOD、POD、CAT酶活性效果最好，分别较对照提高29.8%、94.0%、183.8%。总体来看，叶面肥处理对提高烟株叶片抗氧化酶活性影响的效应大于生物炭处理；生物炭和叶面喷施ZnSO4联合处理更有利于提高烟株叶片SOD、POD、CAT酶活性 (图1)。

表1 不同处理的烟株株高和生物量Table 1 Plant heights and dry weights of tobacco with different treatments

图1 镉胁迫下不同处理烟株叶片的MDA含量和SOD、POD、CAT活性Fig.1 MDA contents and SOD, POD, CAT activities in tobacco leaves under Cd stress with different treatments

2.3 不同处理对烟株各部位重金属镉含量的影响

烟株各部位 Cd 含量表现为下部叶＞中部叶＞根＞上部叶＞茎。各处理对烟株根、茎、叶Cd含量影响的效应均表现为 CK ＞ K ＞ Zn ＞ B ＞ B + K ＞ B + Zn。对烟株根部的镉含量而言，B、Zn、K、B + K、B +Zn处理与CK相比均显著降低烟株根部镉含量 (P＜0.05)，Zn和K处理之间无显著差异 (P＞ 0.05)；对烟株茎部的镉含量而言，B、Zn、K、B + K、B +Zn处理与CK相比均显著降低烟株茎部镉含量，B、Zn和K处理之间无显著差异；对烟株上部叶镉含量，B、Zn、K、B + K、B + Zn处理与CK相比均显著降低烟株上部叶镉含量，Zn和K处理之间、B +K和B + Zn处理之间无显著差异；对烟株中部叶镉含量，B、Zn、K、B + K、B + Zn处理与CK相比均显著降低烟株中部叶镉含量，B和Zn处理之间无显著差异；对烟株下部叶镉含量，B、Zn、K、B + K、B + Zn处理与CK相比均显著降低烟株下部叶镉含量，不同处理间均表现出显著差异。B + Zn处理对降低烟株根、茎、上部叶、中部叶、下部叶重金属镉含量效果最佳，分别较对照降低53.9%、74.5%、63.1%、63.6%、63.8%。总体来看，生物炭结合叶面喷施ZnSO4更利于减少烟株对重金属镉的积累 (图2)。

2.4 不同处理对烟株镉的生物富集系数和转运系数的影响

与CK相比，生物炭与叶面肥单独应用及其联合配施均显著降低烟株Cd的生物富集系数和转运系数(P＜ 0.05)。各处理对烟株镉的生物富集系数和转运系数影响的效应均表现为 CK ＞ K ＞ Zn ＞ B ＞ B + K ＞B + Zn。

对于富集系数而言，Zn和K处理之间、B +K和B + Zn处理之间无显著差异 (P＞ 0.05)，以B +Zn处理烟株镉的生物富集系数最低，与CK相比降低64.4%。

图2 不同处理烟株各部位重金属镉含量Fig.2 Cadmium contents in different parts of tobacco with different treatments

对转运系数而言，K和Zn处理间无显著差异，以B + Zn处理烟株镉的生物转运系数最低，与CK相比降低32.3%。

总体上，生物炭配合叶面喷施ZnSO4更利于降低烟株对重金属Cd的富集和转运 (图3)。

2.5 不同处理对土壤重金属镉形态的影响

不同处理下土壤重金属Cd各形态含量表现为可还原态＞弱酸提取态＞可氧化态＞残渣态。与对照相比，B、B + Zn和B + K处理显著降低土壤弱酸提取态和可还原态Cd含量，弱酸提取态Cd含量分别较对照降低12.9%、19.5%、16.9%，可还原态Cd含量分别较对照降低24.4%、22.9%、23.7%；B、B +Zn和B + K处理增加可氧化态和残渣态Cd含量，可氧化态Cd含量分别较对照增加53.9%、62.5%、61.8%，残渣态Cd含量分别较对照增加177%、207%、193%。Zn、K处理对弱酸提取态和可还原态Cd含量，可氧化态和残渣态Cd含量均无显著影响 (P＞0.05)。B、B + K和B + Zn处理对降低可还原态、弱酸提取态Cd含量，增加可氧化态、残渣态Cd含量无显著差异。总体来看，施加生物炭对降低弱酸提取态和可还原态Cd含量，增加可氧化态和残渣态Cd含量效果较好，喷施叶面肥对土壤Cd形态转化无显著影响 (图4)。

图3 不同处理烟株中镉的生物富集系数和转运系数Fig.3 Bio-concentration factors and transfer factors of cadmium of different treatments

图4 不同处理的土壤中各形态镉含量Fig.4 Soil cadmium fractions of different treatments

3 讨论

曹晨亮等[22]研究表明，重金属镉污染土壤上添加钝化剂可显著降低重金属对烟株的毒害，提高烟叶产量，赤泥、油菜秸秆、玉米秸秆及其组合并配施硫酸锌可使烟叶增产7.0%～32.1%，烟草经济效益提高6.6%～31.3%，且以赤泥油菜秸秆复合钝化剂配施锌肥效果最佳。

本研究结果表明生物炭和叶面肥均能显著提高烟株生长和干物质积累，以及烟株叶片的SOD、POD和CAT活性。生物炭能够提高Cd胁迫下烟株生长和抗性可能是因为：1) 生物炭具有多孔结构，施入重金属污染土壤中、为土壤微生物提供良好的栖居环境，增强了参与土壤有机养分分解的微生物活性，为植物生长提供了有效利用的养分[5-10]；2) 生物炭施入土壤后降低了重金属的转运和积累，减少镉对烟株的毒害[23-24]。叶面肥富含植物生长所必须的营养元素，喷施叶面肥有利于烟株对营养元素的吸收，调节烟株地上部分的生长，增强烟株的抗性[25]。

本研究还发现生物炭配合叶面喷施ZnSO4对提高Cd胁迫下烤烟的生长和抗氧化能力效果最佳，喷施Zn肥效果好于喷施K肥。这可能是因为生物炭为烟株改善了根际生长环境，而Zn元素是叶绿体中碳酸酐酶的重要组成部分，提高了烟株的光合作用强度[26]，二者对烟株生长起到了协同作用。喷施Zn肥效果好于喷施K肥可能是由于生物炭自身K含量较高，施入土壤后提高了土壤的钾含量，从而减少叶面对K+的吸收，降低了烟株对Cd2+吸收的阻控效应，因此喷施Zn肥效果好于喷施K肥。

本研究结果发现生物炭能够较好地阻控烟株对Cd的富集和转运，减少Cd的吸收积累，降低烟草各部位Cd含量。这可能是因为：1) 生物炭表面带有大量负电荷与土壤中的金属离子产生静电作用，Cd2+被吸附固定，降低了Cd2+的移动性[27]；2) 生物炭表面分布着很多含氧官能团 (如羧基和羟基)，增加土壤表面的吸附位点，Cd2+与这些官能团结合形成金属络合物，从而降低Cd的有效性[28]；3) 生物炭的碱性性质 (本研究中生物炭pH值为 10.4)，施入土壤后可能使得土壤中重金属离子形成氢氧化物、碳酸盐或磷酸盐而沉淀，有利于可还原态镉的形成和稳定[29-30]。

吴萍萍等[23]研究也指出，在矿区重金属污染土壤中施加生物炭可减少土壤可还原态Cd含量，增加残渣态Cd含量，增幅为40.9%～191.9%。李衍亮等[31]研究发现在重金属污染农田中施用生物炭可降低土壤重金属的生物有效性，减少在玉米中的镉积累，其中玉米籽粒中Cd含量降低幅度为45.4%。

喷施Zn、K叶面肥能够降低烟株对Cd的积累转运，表现出明显的“离子拮抗”作用，这可能是因为：一方面烟株对叶面肥中金属阳离子的吸收，调控了细胞中金属阳离子的浓度，及时关闭金属阳离子载体蛋白基因表达，减少土壤中Cd2+向地上部转运，从而调控烟株对重金属镉的吸收[32]；另一方面叶面肥能够促进烟株生长，增加烟株地上部分的生物量，在烟株体内对重金属镉起到“稀释效应”，从而降低镉在烟株中的浓度[33]。

钝化剂与叶面肥联合处理降低植物Cd积累的研究已有部分报道，如徐奕等[34]研究表明坡缕石与叶面硅肥联合施用能有效降低水稻地上部Cd吸收，秸秆中重金属Cd含量最大可降低68.7%。

本研究显示生物炭配施叶面肥促进Cd胁迫下烟株生长，提高抗氧化性，降低Cd富集转运效果最佳。这可能是由于生物炭能够调控土壤微环境的理化性质，为根系营养吸收和根际有益微生物繁殖提供了良好条件，且对土壤重金属离子有较强的吸附钝化作用，可从根部调控烟株对重金属镉的吸收[35-36]；而叶面吸收的Zn2+、K+抑制了烟株对重金属阳离子的吸收，表现出较强的“离子拮抗”作用，可从地上部调控烟株对重金属镉的吸收[32]，因此，在农业生产中生物炭结合喷施叶面肥从调控土壤中的重金属Cd的形态和阻控地上部对重金属Cd2+转运方面双重支配烟株对重金属镉的吸收，具有良好的叠加效应。本研究结果也表明生物炭配合叶面喷施ZnSO4效果好于生物炭配合叶面喷施KH2PO4，可能是因为Zn2+和重金属Cd2+均为2价态的阳离子，二者的离子拮抗作用较强。