3种不同提取方式对红树莓籽油成分的影响

(中北大学化学工程与技术学院， 山西 太原 030051)

树莓(RubusidaeusL.)，蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)空心莓亚属植物，又名覆盆子、悬钩子、木莓、山莓等[1]。树莓果实肉嫩、多汁，风味独特，除富含氨基酸、维生素、糖类、矿物元素等营养成分之外，还含有丰富的花青素、单宁、鞣花酸、黄酮[2]等功能性成分，被誉为药食同源的“第三代水果”[3]。但树莓极易变质腐烂，不利于运输保存，且树莓果实糖分含量低，口感偏酸，因此除了少量用于鲜食以外，还可初步加工为果汁[4]、果冻[5]、果酱和果酒[6]等食品，或者将树莓提取物作为保健品和化妆品主材或辅料。在加工过程中，残渣中的树莓籽通常作为废料，尚未得到有效的开发利用。树莓籽油中含有亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸，含量高达85.97%[7]，与红花籽油(87.10%)[9]和葡萄籽油(86.84%)[10]中不饱和脂肪酸含量相似。除了脂肪酸，树莓籽油中还含有原花青素和维生素E等多种活性成分，且维生素E含量较高，是红花籽油和葡萄籽油的近6倍[11-12]。除此之外，树莓种子还具有抗血栓[13]、降血脂[14]和抗癌[15]等医疗保健功能。

树莓的挥发性油中含有芳香烃、醛、酮、酯、单萜等物质[16]，存在丰富的三萜类化合物和皂甙。Kimura等发现，茶皂甙可以通过抑制胰脂肪酶活性，实现高脂饮食小鼠的抗肥胖作用[17]。Ge等研究发现，茅莓总皂甙可诱导白血病细胞株K 562凋亡[18]；但目前对树莓总皂甙的研究尚不完善。

目前植物油的提取方法主要是机械压榨法、水蒸气蒸馏法和有机溶剂萃取法，有机溶剂萃取法又包括索氏提取(SE)、超声波辅助提取(UAE)和超临界CO2法萃取等[19]。鉴于树莓籽含量较少(干重占树莓鲜果的9%～12%[20])，且含油量不高等特点，选择超声辅助乙醇提取法(Ultrasonic-assisted extraction-ethanol，UAE-Et)、超声辅助石油醚提取法(Ultrasonic-assisted extraction-petrol ether，UAE-PE)和索氏石油醚提取法(Soxhlet extraction-石油醚，SE-PE)，研究3种不同提取方式对红树莓籽油成分的影响，比较红树莓籽油的提取率、油脂成分、抗氧化活性和总皂甙含量的差异，为不同用途的树莓籽油找到最合适的提取方式，为红树莓籽油的进一步开发与利用提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

红树莓来味里(RubusidaeusL.var.Reveille)冷冻鲜果，于-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要试剂及药品

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH；色谱级)和齐墩果酸(色谱级)：上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钾、甲醇、氯化钠、盐酸、无水乙醇、石油醚(60～90 ℃)、高氯酸(70%～72%)、香兰素、冰乙酸和乙酸乙酯均为分析纯。

1.3 主要仪器

CLF-30 B高速连续型超微粉碎机：浙江省温岭市创力药材器械厂；HH-8恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；KQ-250 DE超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SOX 406索氏提取仪：济南舜腾生物仪器有限公司；RE-2000 A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；JH-14-04可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；DNM-960 G酶标分析仪：北京普朗新技术有限公司；Trace 1300-ISQ气相色谱-质谱联用仪：赛默飞世尔科技公司。

2 实验方法

2.1 红树莓籽油的提取

将室温解冻的红树莓果实榨汁匀浆，通过20目筛(0.85 mm)筛分得到红树莓籽。流水冲洗至种子完整干净，在60 ℃下干燥至恒重。用研磨机打粉备用。

UAE-Et参考Teng等[21]的最佳工艺：称取树莓籽粉5 g，置于三角锥形瓶中，加入无水乙醇，提取树莓籽油。提取条件：料液比1∶30，超声功率250 W，提取时间30 min，温度50 ℃，重复提取2次。抽滤后合并树莓籽油的提取液，经旋转蒸发仪于35 ℃除去溶剂。

UAE-PE参考张佰清等[22]的最佳工艺：称取树莓籽5 g，置于三角锥形瓶中，加入石油醚，提取树莓籽油。提取条件：料液比1∶11，超声功率100 W，提取时间25 min，温度30 ℃，重复提取2次。抽滤后合并树莓籽油的提取液，经旋转蒸发仪于35 ℃除去溶剂。

SE-PE参考Teng等[21]的最佳工艺：称取树莓籽5 g，脱脂滤纸包裹置于滤纸架上，再用纱布包裹。量取50 mL石油醚倒入抽提杯，打开抽提仪开始提取。先浸提再抽提。提取条件：料液比为1∶10，温度80 ℃，提取时间180 min。提取完成，经旋转蒸发仪于35 ℃除去溶剂。

所有油液经4 000 r·min-1离心10 min取上层清液。计算提取得率公式如下：

(1)

2.2 红树莓籽油脂肪酸含量测定

参考杨静等[23]的方法，将样品甲酯化，待作GC-MS分析。

GC条件：HP-5 MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；升温程序：初始温度为100 ℃，保持5 min，然后以10 ℃·min-1升至250 ℃，保持10 min；进样量为0.2μL；载气(高纯氦气)流量为1.5mL·min-1，分流比为20∶1；溶剂延迟3 min。

表1 3种提取方式红树莓籽油的脂肪酸组成和相对含量

序号Rt/min化合物名称 分子式 分子量相对含量/%UAE-EtUAE-PESE-PE17.053-乙基己烷C8H181140.110.040.1227.282,2-二甲基己酮C8H16O1280.20.14—37.872-乙基己醇C8H18O1300.150.1—47.97γ-松油烯C10H161360.14——58.01芳樟醇C10H18O1540.16——68.21十三烷C13H281840.10.060.08710.51十四烷C14H301980.110.10.14810.86正十五烷C15H322120.180.150.3911.62月桂酸甲酯C13H26O22140.080.020.11011.692,4-二叔丁基酚C14H22O2060.220.03—1113.142-甲基十五烷C16H342260.140.130.081213.51正十六烷C16H342260.180.210.21314.05十三酸甲酯C14H28O22280.250.220.211414.71正十八烷C18H382540.110.160.081515.72正二十烷C20H422820.130.180.091615.95蓖麻油酸C18H34O32980.20.210.251716.13棕榈酸甲酯C17H34O22703.072.943.191816.89十二烷二酸二甲酯C14H26O42580.130.170.141917.82亚油酸甲酯C19H32O229257.4559.1260.822017.90亚麻酸甲酯C19H33O229324.7826.0427.42118.00硬脂酸甲酯C19H38O22980.861.340.732219.42正二十一烷C21H442960.110.110.082319.50(Z)-油酸甲酯C19H36O22960.280.30.362419.68花生酸甲酯C21H42O23260.580.590.662520.50单棕榈酸甘油C19H38O43300.160.110.182621.16二十二烷C22H463100.110.090.12721.46十七烷酸甲酯C18H36O22840.290.230.392823.28正二十四烷C24H503380.28—0.32924.03二乙二醇单硬脂酸酯C22H44O43720.080.110.133024.87木焦油酸甲酯C25H50O2382——0.033125.40麦角甾醇C28H44O3960.11——3226.88二十八烷C28H583940.240.220.26总计91.9993.1296.42ω-6/ω-32.322.272.22

注：“—”低于检出限。

MS条件：电子轰击(EI)离子源；离子源温度230 ℃；进样口温度200 ℃；倍增器电压1 376 V，电子能量70 eV；发射电流34.6μA，接口温度280 ℃。扫描范围为20～500 amu。

2.3 红树莓籽油DPPH自由基清除率的测定

参考Musa等[24]的方法，并作适当修改。将不同提取方式红树莓籽油用无水乙醇配制成不同浓度梯度的溶液。取50μL不同浓度的样品溶液与250μL 0.2 mmol·mL-1的DPPH乙醇溶液在96孔板中混匀，于室温避光静置40 min后在517 nm处测定吸光度A样品。采用相同方法测定50μL无水乙醇溶液和250μL DPPH溶液混匀后的吸光度A空白，以及50μL样品溶液和250μL无水乙醇溶液混合后的吸光度A对照。

DPPH自由基清除率计算公式如下：

清除率(%)=[1-(A样品-A空白)/A对照]×100%

(2)

并根据清除率计算样品的IC50(半抑制浓度，即清除率为50%时对应的样品浓度)。

2.4 红树莓籽油中总皂甙含量的测定

2.4.1标准曲线的测定

参照康琴等[25]的方法，并作适当修改。用分析天平精确称取齐墩果酸标准品，配制成0.18 mg·mL-1的甲醇标准液，分别量取不同梯度的标准液于具塞玻璃试管中，60 ℃水浴吹干，各加入0.2 mL 5%香兰素-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，振荡后于60 ℃水浴中加热15 min后取出，流水冷却中止反应，各加入5 mL乙酸乙酯，振荡摇匀，甲醇作空白，反应30 min后于547 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以样品质量为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程为Y=5.021 8X+0.085 5，r2=0.999，在0～150μg范围内有良好的线性关系。

2.4.2样品中总皂甙含量的测定

准确称取(40±1)mg的不同样品，用甲醇溶解在25 mL容量瓶中定容。取0.1 mL于具塞玻璃试管中，60 ℃水浴挥干，挥干后按上述步骤进行测定。

2.5 数据处理

利用Excel 2010软件和Origin 8.0软件进行数据统计和图表制作，用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析和多重比较。

3 结果与讨论

3.1 3种提取方式红树莓籽油提取率

3种提取方式红树莓籽油的提取率如图1所示。由图1可知，UAE-Et红树莓籽油的提取率最高，为18.55%，UAE-PE提取率为10.18%，SE-PE提取率为13.58%。根据文献中的最佳工艺，UAE-Et、UAE-PE和SE-PE的提取率分别为23.06%、12.97%和15.02%[21-22]。不同提取方式的提取率与文献结果相似，略低，且趋势相同，均为UAE-Et>SE-PE>UAE-PE。由此可见，不同提取方法的提取率差异较大，这与Péres等[26]的研究结果一致。因此，超声辅助提取的操作简单，提取效率更高，更适合红树莓籽油的提取，且在超声辅助提取的条件下，乙醇作为溶剂效果更好，且毒副作用较小。

图2 UAE-Et红树莓籽油的总离子流图

注：利用单因素方差分析进行差异显著性分析，多重比较方法为Duncan(α=0.05)法，不同字母表示差异显著(p<0.05)。图1 3种提取方式红树莓籽油提取率

3.2 红树莓籽油脂肪酸

UAE-Et红树莓籽油的总离子流图如图2所示。采用峰面积归一化法得出各组分的相对含量，各色谱峰相应的质谱图检索采用NIST标准谱库进行检索，并逐个解析各峰相应的质谱图，定性定量结果见表1。由表1可知，不同提取方式红树莓籽油中共鉴定出32种物质，占物质总量的91.99%～96.42%。UAE-Et鉴定物质种类最多，共31种，其中包括4种不饱和脂肪酸，占物质总量的82.71%：亚油酸(57.45%)、亚麻酸(24.78%)、油酸(0.28%)、蓖麻油酸(0.2%)；7种饱和脂肪酸，占物质总量的5.26%：棕榈酸(3.07%)、硬脂酸(0.86%)和花生酸(0.58%)等；21种其它物质：正二十四烷(0.28%)、正十五烷(0.18%)、二十八烷(0.24%)等烷烃类以及芳樟醇(0.16%)等醇类和γ-松油烯(0.14%)等萜烯类物质。UAE-Et红树莓籽油中不饱和脂肪酸含量最少，但含有物质种类最多，且含有萜烯类、酮类、醇类等物质。Teng等[25]采用超声辅助法得到的红树莓籽油成分与该结果差异较大，不饱和脂肪酸含量高达90%，且不含烷烃类、醇类和萜烯类等物质，这可能与原料产地、品种等差异有关。

UAE-PE共鉴定出27种物质，其中包括4种不饱和脂肪酸(占物质总量的85.76%)：亚油酸(59.12%)、亚麻酸(26.04%)、油酸(0.3%)、蓖麻油酸(0.21%)；7种饱和脂肪酸(占物质总量的5.51%)：棕榈酸(2.94%)、硬脂酸(1.34%)、花生酸(0.59%)；16种其它物质：二十八烷(0.22%)、正十六烷(0.21%)、正二十烷(0.18%)等烷烃类以及2-乙基己醇(0.1%)等醇类和2,2-二甲基己酮(0.14%)等酮类物质。SE-PE红树莓籽油中共鉴定出26种物质，其中包括4种不饱和脂肪酸(占物质总量的88.83%)：亚油酸(60.82%)、亚麻酸(27.40%)、油酸(0.36%)、蓖麻油酸(0.25%)；8种饱和脂肪酸(占物质总量的5.45%)：棕榈酸(3.19%)、硬脂酸(0.73%)、花生酸(0.66%)；14种其它物质：正二十四烷(0.30%)、正十五烷(0.30%)、二十八烷(0.26%)等烷烃类物质。3种提取方法得到的红树莓籽油中物质种类有差异，这可能是超声辅助提取法和索氏提取均利用“相似相溶”的原理[27]，不同溶剂的产物略有差异，且索氏提取法温度较高，可能对小分子的物质结构有破坏[28]。

多个机构对膳食中ω-6/ω-3脂肪酸的均衡比例提出了建议：联合国粮农组织建议5∶1～10∶1[29]，中国营养学会推荐的ω-6/ω-3脂肪酸比例为4∶1～6∶1[30]。研究表明，降低ω-6/ω-3脂肪酸比例有助于降低患癌症[31]和心血管疾病的风险[32]。但是，Simopoulos等[33]研究指出，目前人类日常饮食中ω-6/ω-3脂肪酸比例过高并呈现逐年上升趋势，2000年为10∶1～20∶1，2003年为10∶1～30∶1。UAE-Et、UAE-PE和SE-PE红树莓籽油的ω-6/ω-3脂肪酸比例为2.22∶1～2.32∶1(见表1)，明显低于生活中常用大豆油(8.62∶1)和花生油(25.34∶1)[8]，对改善ω-6/ω-3脂肪酸比例更有效。因此，红树莓籽油有助于改善我国居民膳食中过高的ω-6/ω-3脂肪酸比例，调整ω-6/ω-3脂肪酸比例在合适的范围内[34]。

3.3 3种提取方式红树莓籽油DPPH自由基清除率

由图3可见，3种提取方式得到的红树莓籽油对DPPH自由基均有清除作用。根据清除率曲线，计算出不同提取方式红树莓籽油的DPPH自由基IC50分别为：IC50 UAE-PE(27.43 mg·mL-1)>IC50 SE-PE(5.89 mg·mL-1)>IC50 UAE-Et(4.36 mg·mL-1)。由此可得，不同提取方式红树莓籽油对DPPH自由基清除作用的大小为：UAE-Et>SE-PE>UAE-PE。Asensio等研究发现，氧化单萜与酚类协同比单独的酚类有更强的抗氧化性[35]，表明酚类可能与氧化单帖有协同作用。UAE-Et红树莓籽油中含有较多的烯萜类物质，如γ-松油烯、芳樟芳樟醇、麦角甾醇等，因此，含有烯萜类物质的红树莓籽油具有更高的抗氧化活性。

图3 3种提取方式红树莓籽油的IC50值

3.4 3种提取方式红树莓籽油中的总皂甙含量

3种提取方式红树莓籽油中总皂甙含量如图4所示。由图4可见，3种提取方式红树莓籽油中总皂甙含量分别为：UAE-Et(351.88 mg·g-1)>UAE-PE(267.66 mg·g-1)>SE-PE(178.45 mg·g-1)。UAE-Et、UAE-PE和SE-PE 3种提取方式红树莓籽油的提取率分别为18.55%、10.18%和13.58%，因此红树莓籽中的总皂甙含量分别为：65.27 mg·g-1、27.25 mg·g-1和24.23 mg·g-1。赵伟伟测量了树莓根、茎、叶片和侧枝中的总皂甙含量，在10～15 mg·g-1之间，各不同器官总皂甙的平均含量为11.3 mg·g-1，红树莓籽中的总皂甙含量均高于这一值[36]。该结果与3.2项中GC-MS鉴定结果一致，进一步证明UAE-Et红树莓籽油中萜烯类物质含量更高，抗氧化活性更强。

图4 3种提取方式红树莓籽油总皂甙含量

4 结 论

采用3种不同的提取方法提取红树莓籽油，通过GC-MS鉴定分析比较不同提取方式红树莓籽油的脂肪酸组成，并通过DPPH自由基清除实验测定其体外抗氧化活性，最后测定其总皂甙含量。结果表明，UAE-Et红树莓籽油提取率更高，为18.55%，所含物质种类最多为31种，体外抗氧化活性更强，IC50值为4.36 mg·mL-1，且总皂甙含量更高，为351.88 mg·g-1。但其不饱和脂肪酸含量为82.71%，小于UAE-PE(85.76%)和SE-PE(88.83%)。同时，UAE-Et、UAE-PE和SE-PE红树莓籽油的ω-6/ω-3脂肪酸比例均小于大豆油和花生油，在改善我国居民膳食ω-6/ω-3脂肪酸比例中有着重要作用。因此，可根据不同作用，采用不同的提取方式对红树莓籽油进行提取，具有广阔的应用和开发前景。