HPLC同时测定炙黄芪配方颗粒特征图谱及毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量△

2019-07-13姚娜黄燕明李雪银陈桂生

中国现代中药 2019年6期

姚娜，黄燕明，李雪银，陈桂生

1.广州市香雪制药股份有限公司，广东广州 510663；2.宁夏隆德县六盘山中药资源开发有限公司，宁夏固原 756300

炙黄芪配方颗粒是以炙黄芪饮片为原料，经水提、浓缩、干燥、制粒、包装等工艺制备而成。原料炙黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根炮制加工品。其具有益气补中，临床上用于气虚乏力，食少便溏[1]。黄芪中的主要化学成分研究及相关的药理作用已有报道[2-4]，其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷是主要的有效成分之一。黄芪经炮制后，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量有明显变化[5-7]。目前国内尚无关于HPLC同步测定炙黄芪配方颗粒特征图谱和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的文献报道，国家也尚未出台该中药配方颗粒的质量标准。为了有效控制和评价炙黄芪配方颗粒的质量，本研究采用HPLC建立了同步测定炙黄芪配方颗粒的特征图谱并对指标成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行定量检测的方法[8]。

1 材料

1.1 仪器

十万分之一电子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)；超纯水器(Simplicity，美国密理博Millipore公司)；数控超声波清洗器(KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司)；Ultimate 3000 DGLC高效液相色谱仪；Agilent 1200高效液相色谱仪。

1.2 试药

蒙古黄芪对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120974-201311，规格：1 g/瓶)；膜荚黄芪对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121462-201304，规格3 g/瓶)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷(中国食品药品检定研究院，批号：111920-201505，纯度：97.1%)；乙腈、甲酸均为色谱级；甲醇为分析纯。

炙黄芪配方颗粒10批来自广州市香雪制药股份有限公司，批号依次为S1～S10；麦芽糊精来自湖州展望药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A，以0.2%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱方式0～40 min，10%～50%A，90%～50%B；检测波长为254 nm；柱温25 ℃；进样量为10 μL。理论塔板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3000。

2.2 对照品溶液的制备

取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取炙黄芪配方颗粒约1 g，研细，精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4 测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。

2.5 10批样品的检测结果

分别取10批炙黄芪配方颗粒，按2.3项下方法制备10份供试品溶液，按2.1项下的色谱条件测定，得到10批炙黄芪配方颗粒的毛蕊异黄酮葡萄糖苷的质量分数分别为0.317 2、0.309 1、0.317 3、0.311 2、0.318 5、0.313 3、0.678 8、0.691 3、0.683 4、0.687 8 mg·g-1，平均质量分数为0.462 8 mg·g-1；得到10批炙黄芪配方颗粒的色谱叠加图，见图1，通过对10批的色谱图进行分析，有4个色谱峰能稳定重现，故确立了4个特征峰，其中1号峰的保留时间及紫外光谱与毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品吻合，故供试品特征图谱中1号峰鉴定为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，相对保留时间的规定值为：1.00(峰1)、1.46(峰2)、1.75(峰3)、2.38(峰4)。

2.6 特征图谱方法学考察

2.6.1 专属性试验取炙黄芪配方颗粒、麦芽糊精、蒙古黄芪对照药材及膜荚黄芪对照药材分别按2.3项下方法制备，按2.1项下的色谱条件测定，见图2。结果表明，4个共有色谱峰的鉴定均不受溶剂及辅料等因素干扰，具有良好的专属性。

2.6.2 精密度试验取同一批炙黄芪配方颗粒供试品溶液，按2.1项下的色谱条件于高效液相色谱仪上连续进样6次，记录色谱图。以1号峰毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰为参照，对各图谱的特征峰的相对保留时间进行计算，结果各图谱特征峰相对保留时间的RSD值为0%～0.07%，各主要色谱峰的相对保留时间无明显变化，表明仪器精密度良好。

注：S1.201503001批次；S2.201503002批次；S3.201503003批次；S4.201503004批次；S5.201503005批次；S6.201503006批次；S7.201503007批次；S8.201503008批次；S9.201503009批次；S10.201503010批次。图1 10批炙黄芪配方颗粒HPLC特征图谱叠加图

注：S1.空白溶剂；S2.阴性对照；S3.毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品；S4.蒙古黄芪对照药材；S5.膜荚黄芪对照药材；S6.炙黄芪配方颗粒。图2 炙黄芪配方颗粒特征图谱专属性试验

2.6.3 重复性试验取同一批炙黄芪配方颗粒样品，平行6份，按2.3项下方法制备，按2.1项下的色谱条件分别进样，记录色谱图。以1号峰毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰为参照，对各图谱的特征峰的相对保留时间进行计算，结果各图谱特征峰相对保留时间的RSD值为0%～0.07%，各主要色谱峰的相对保留时间无明显变化，表明方法的重复性良好。

2.6.4 稳定性试验取同一批炙黄芪配方颗粒供试品溶液，按2.1项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24、48 h进样，记录色谱图。以1号峰毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰为参照，对各图谱的特征峰的相对保留时间进行计算，结果各图谱特征峰相对保留时间的RSD值为0%～0.07%，各主要色谱峰的相对保留时间无明显变化，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.6.5 中间精密度试验分别考察不同分析人员、不同日期、不同设备对精密度的影响，结果不同影响因素下各图谱特征峰相对保留时间的RAD值在0%～0.63%，各主要色谱峰的相对保留时间无明显变化，表明该方法精密度良好，随机变动因素不影响该方法精密度。

2.6.6 耐用性试验取同一批炙黄芪配方颗粒供试品，分别使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Elite Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3种型号的色谱柱，测定炙黄芪配方颗粒的特征图谱，记录色谱图。

以1号峰毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰为参照，各图谱特征峰相对保留时间的RSD值小于2.84%，各主要色谱峰的相对保留时间无明显变化，表明该方法耐用性良好。

2.7 含量测定方法学考察

2.7.1 线性关系及范围取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液(质量浓度：49.33 μg·mL-1)，采用自动进样器分别进样0.1、0.5、1、2、5、10、15、20 μL，在260 nm下测定，即毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量为0.004 9、0.024 7、0.098 7、0.246 6、0.493 3、0.740 0、0.986 6 μg，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积积分值对毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品的进样量进行回归分析，其回归方程为：Y=37.68X-0.016，相关系数r=1；结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在0.004 9～0.986 6 μg，浓度与峰面积呈良好线性关系。

2.7.2 重复性试验同2.6.3项下进行含量测定，并对所得数据进行处理，RSD为2.88%，结果表明该方法重复性良好。

2.7.3 稳定性试验同2.6.4项下测定，对照品溶液和供试品溶液的RSD分别为0.41%、1.05%，表明炙黄芪配方颗粒供试品溶液及毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液在48 h内稳定性良好。

2.7.4 加样回收率试验精密称取已测毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的炙黄芪配方颗粒适量，平行9份，分别精密加入低、中、高浓度的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，按供试品项下操作，依法测定，平均回收率为96.26%，RSD为2.80%，结果表明该方法回收率良好。

2.7.5 中间精密度试验同2.6.5项下测定，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的RAD在0.11%～0.59%，表明该方法中间精密度良好。

2.7.6 耐用性试验同2.6.6项下测定，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的RSD为0.56%，表明该方法耐用性良好。