上海地区人群丙型肝炎病毒1b型进化树及其影响因素分析

丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科黄病毒属，为单正链RNA病毒[1]。HCV基因组全长9.6 kb，包含有5′ 非编码区(5′UTR)、3′UTR及一个编码约3 000个氨基酸的单一开放读码框(ORF)。HCV在宿主体内复制，每日能产生1 012个病毒[2]。由于HCV 非结构蛋白(NS)5B RdRp缺乏校错功能，HCV每复制一代可产生104～105个碱基突变[3-4]。因此，HCV在宿主体内以“准种”形式存在。准种内的病毒，其保守区同源性在91%～99%，变异部分主要为高变区-1(HVR-1)、HVR-2。目前HCV基因型可分为HCV1～7型，基因型之间的序列差异约为30%。每个基因型又可分为不同的基因亚型，基因亚型间的序列差异为15%～20%[5]。研究显示中国人群中HCV基因型主要为HCV 1b型(66%)，其次为2a型(14%)；但中国不同地区的HCV基因型分布存在差异，珠江三角洲地区HCV 6a型为第2大基因型[6]。目前中国HCV序列演变的规律及特征尚未明确，本研究通过扩增HCV 1b型NS3区序列，分析HCV 1b型序列变异情况、序列进化以及演变的规律，并进行人类白细胞抗原-A(HLA-A)及HLA-B类分子基因分型检测，分析上海地区人群的HLA-Ⅰ类分子遗传背景，明确上海地区人群的HLA-Ⅰ类分子对于HCV 1b型序列进化的影响。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2010年7月至2015年4月期间上海交通大学附属第一人民医院消化科及感染科诊治的89例慢性丙型肝炎患者，患者均为汉族，均对本研究知情同意。慢性丙型肝炎诊断标准参考2014年欧洲肝脏病协会(EASL)HCV感染诊治指南[7]，选择HCV抗体阳性，HCV RNA阳性(HCV RNA定量检测结果在1.23 E+03～6.61 E+07 copies/mL)患者，排除近6个月内感染的患者。使用EDTA抗凝管采取全血标本。所有标本均排除人类免疫缺陷病毒(HIV)或乙型肝炎病毒(HBV)合并感染。

1.2 HCV RNA抽提及NS3区扩增

分离血清，抽提血清中HCV RNA(Qiagen病毒RNA抽提试剂盒)，采用型别特异性引物扩增法对HCV RNA进行基因分型。采用巢式PCR对HCV 1b基因型的HCV NS3区进行扩增，反应体系及循环参数按照 TaKaRaTaq 聚合酶说明书。取10 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，于紫外光下成像，观察结果。将NS3区扩增阳性条带产物送至上海英俊生物技术有限公司测序。

1.3 HCV序列分析

测序结果使用 CodonCode Aligner 软件，参考序列峰图进行拼接后得到核苷酸序列。使用Align软件进行同源性分析。使用Ge-neious 7.0软件进行核苷酸及氨基酸序列分析。使用TreeMaker和FigTree软件，基因距离使用GTR方法，分析HCV NS3区的序列变异情况，并进行进化树分析。

1.4 HLA-A和HLA-B类分子测定

分离血细胞，进行基因组DNA抽提，采用型别特异性引物PCR法检测HCV 1b型患者相应的HLA-A及HLA-B类分子等位基因。分析人群HLA-A及HLA-B类分子基因频率，并与数据库中国人群HLA-A及HLA-B类分子基因频率比较。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料的比较采用独立样本t检验，组间HLA-A和HLA-B类分子频率比较采用卡方检验，HLA-Ⅰ类分子阳性及阴性患者中序列突变频率比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCV 1b型NS3区扩增

将PCR阳性结果送测序后，应用CodonCode Aligner软件，根据测序峰图进行序列拼接，最终得到89例HCV 1b型NS3区的全长核苷酸及氨基酸序列，序列经进化树分析后最终证实为1b型。

2.2 上海地区人群的HLA-A及HLA-B类分子基因分布情况

表1 HLA-A分子基因频率

表2 HLA-B分子基因频率

2.3 中国不同地区人群中HLA-A和HLA-B类分子基因频率比较

图1中国不同地区人群中HLA-A和HLA-B类分子基因频率比较AHLA-A类分子基因频率BHLA-B类分子基因频率

2.4 上海地区人群中HCV 1b型序列演变分析

将本研究扩增获得的89例HCV 1b型NS3区进行进化树分析，结果显示89例序列主要落于两个进化丛内，见图2。

图2 上海地区人群中HCV 1b型序列进化树分析

2.5 HCV NS3区序列进化丛形成的影响因素

表3 不同进化丛中HLA-A及HLA-B类分子基因频率比较

2.6 不同进化丛的一致序列比对结果

将进化丛1以及进化丛2序列分别进行序列比对，得到各自一致序列，再将不同进化丛一致序列与中国地区所有序列的一致序列以及HCV 1b型标准序列进行序列比对。结果显示进化丛1与中国所有序列的一致序列高度一致，同源性达100%，进化丛1的一致序列与HCV 1b型标准序列之间的同源性为96.67%，进化丛2的一致序列与标准序列之间的同源性为96.2%。本研究结果显示，HCV 1b型NS3区631个氨基酸中共有25个位点与标准序列不一致，其中14个位点位于已报道的T细胞表位内。

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