流式细胞术工业生产中有关细菌检测的应用

王 丹 王少鹏 冯军超 徐兴鲁 邢立超

山东新创生物科技有限公司 山东 济南 250101

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)从20 世纪60 年代后期创建以来,发展迅速,最初主要用于科学研究和临床试验[1],在微生物领域应用较少,并且起步相对较晚,但是近年来,在国外流式细胞术已经广泛应用于微生物的相关检测,而国内在这方面的应用则较少。

并且,随着电子、激光、计算机等方面的快速发展与进步,流式细胞仪也在不断完善与更新,如今流式细胞仪已经在微生物检测中扮演着越来越重要的角色。微生物中,特别是细菌,在生产或研究中往往需要对其进行快速测定,并且也需要也对细菌数量、大小、活性等进行多参数分析,而流式细胞仪自身的特性恰好符合这样的检测需求[2]。目前,已经有较多相关检测方法的报道,本文中主要从细菌计数、无菌检查、生产在线监测等几个方面,介绍流式细胞仪在工业生产中细菌检测相关应用。

1 流式细胞仪的结构及工作原理

流式细胞仪的结构一般可以分为5个部分,包括流动室及液流驱动系统、激光光源及光束形成系统、光学系统、信号检测显示储存分析系统、细胞分选系统。

将待测样本制备成单细胞悬液,经特异性荧光染料染色后放入样品管中,在气体的压力下,进入充满流动的鞘液。当鞘液压力和样品压力达到一定程度的压差,在鞘液的约束下细胞排列成单列,由流动室的喷嘴流出,形成细胞注经过激光聚焦区,与入射的激光束垂直想交,经特异的荧光染料染色的细胞被激光激发产生特定波长的荧光。仪器中一系列光学系统,收集荧光等光学信号,由计算机系统进行收集、存储、显示并分析被检测到的各种信号,对各种指标做出统计分析[3]。

2 FCM 在细菌计数中的应用

传统的细菌计数方法为微生物平板计数法或者显微镜计数板计数,虽然这种计数方法适用范围广,但是也存在较多难以克服的缺点,如时间长、操作步骤复杂、工作量大等,并且微生物平板计数法仅能对活菌计数,对于失去活性的细菌则无法计数。

而流式细胞术,可以克服传统计数方法耗时长、操作步骤繁琐等问题,并且可以区分出细菌的死活,并进行定量分析。王银环等[4]使用BD FASS Microcount检测了3种地衣芽孢活菌制剂中的活菌数、芽孢数和芽孢率,测定过程简单、便捷、快速,并且与传统的平板计数法相比无显著性差异,检测结果稳定可靠；汪沐等[5]建立了荧光原位杂交和流式细胞术结合(FISH-FCM)快速测定肉食品中肠杆菌的方法,与传统平板培养方法相比,极大的缩短了检测时间,并且该方法的检出率为100%,适用性较强；姜凯[6]构建了流式细胞术检测乳酸菌数量的方法,通过使用PI(碘化丙锭)和SYTO©24两种荧光染料对死菌和活菌染色,对10多个批次的发酵剂、发酵乳饮料、发酵乳等产品进行了检测,与现行国标方法进行对比,并无显著性差异,且重现性好、单个样品检测时间不超过5min,极大的缩短了检测周期,克服了检测严重滞后于生产过程的难题。

此外,刘春春等[7]在对枯草芽孢杆菌的多态异质性分析中,使用BD Influx(spo),对50nm～500nm 标准尺寸微球进行灵敏度分析,结果显示在对300nm 以上的微粒均具有较高的灵敏度,这解决了细菌休眠体芽孢等小微粒难以精确分析的难题,促进了流式细胞术进一步发展。

3 FCM 在无菌检测中的应用

在药品生产中,微生物无菌检查是控制保证药品质量的关键因素,是生产中必不可少的监测指标。各国药典中的无菌检查方法均是通过观察培养基培养后的混浊情况来判断产品的无菌情况,此方法同样具有检测周期长、操作过程复杂等缺点。

近些年来,国内外已经有出现较多新兴方法进行无菌检查,由于检测时间快、灵敏度高,流式细胞术也较多的用于无菌检查。宋光艳等[8]使用SYTO9荧光染料对药品中的微生物进行荧光标记后,采用流式细胞术对两种类型(溶液和无菌粉末)注射剂检测,检出限均＜10CFU,与药典法相比,检出时间比常规方法缩短40%～70%,可作为法定检查方法的有效补充；Mohr H 等[9]使用噻唑橙荧光染料对10余种细菌进行荧光标记后,使用流式细胞术对PCs(血小板浓缩物)进行检测,研究显示,在接种大约1CFU/m L的细菌,37℃孵育的条件下,多数种类细菌在21小时内或更短的时间内可以被检测到；卢昕等[10]采用流式细胞术对接处镜护理液进行无菌检查,结果显示当污染量在1～109CFU 范围时,可直接得出含菌量,同时可有效缩短检出时间。

此外,也有许多其它检测方法用于无菌检查,如采用生物热动力学方法、Q-PCR 方法等[10],与传统方法相比,均具有缩短检测周期、操作流程简单等特点,这极大的提高了生产效率,加快了产品投入市场。

4 FCM 在生产在线监测中的应用

由于生产中终产品的的合格依靠于生产中各个环节的质量控制,因此在生产中实施在线监测具有重要意义。

目前,国外已有研究人员采用流式细胞术对生产中在线监测技术进行了探索。2000年设计了一种强大的流式细胞检测系统(FI-FCM),通过此检测系统的在线监测系统,得到了大肠杆菌发酵培养过程的完整生长曲线[8]；亦应用FI-FCM 流式细胞检测系统,通过频繁采样(每5min一次),实现在线、实时监测生物反应器中微生物细菌的生长变化情况；应用具有毫秒分辨率的RT-FCM(Real time Flow Cytometry)流式细胞检测系统,实时监测生物反应器中多样微生物的高动态发展过程,文中通过进行4个不同微生物相关研究方向的实验,证明此检测系统在对各种生物实验的广泛适用性和可以对具有复杂的生物过程如发酵等收集到更加详细、时间上更加连续的信息,这也有助于工业生产中优良菌株的筛选[3]。

而国内还较少应用流式细胞术对生产过程进行在线监测,更多是应用在海洋生态系统中生物的实时监测[11],如果将FCM 更多的应用在工业生产中,尤其是微生物发酵等过程,能够更好地收集到菌体发酵多参数的信息,这对整个生产工艺过程的质量控制具有重大意义。

总结

除了在工业生产中,流式细胞术也广泛应用于在科学研究、临床检测、生态环境等各个领域,尤其对一些微小粒子来说,其具有的逐个分析、灵敏、快速、多参数分析等优势,更是受到了大家的青睐；虽然流式设备一般价格昂贵,前期成本较高,但是相信随着科技的飞速发展,难题也将逐渐解决,流式细胞术也将有更加广阔的应用前景。