86份酸枣种质资源筛选和遗传多样性分析

李世鹏 陈叶 郭明欣 田珊 刘红霞 赵旭升

摘要 [目的]综合酸枣种质资源主要农艺性状评价和遗传多样性分析结果，筛选优良酸枣种质资源。[方法]对86份酸枣种质资源的15个农艺性状进行表型鉴定，并利用9个ISSR标记进行遗传多样性分析。[结果]通过对15个农艺性状综合评价，从86份酸枣种质资源中筛选出5份优良种质资源。9对ISSR引物共扩增出20条多态性条带，多态性信息量（polymorphism information content，PIC）为0.60～0.81，平均值为0.70。在遗传系数0.57的水平上86份酸枣种质资源被分为两大类，其中79份种质资源聚为A类，7份种质资源聚为B类。[结论]该研究为酸枣种质资源分类、鉴定和新品种选育等提供理论依据。

关键词 酸枣;农艺性状;ISSR标记;遗传多样性

中图分类号 S603文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）11-0051-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.017

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Abstract [Objective] The main agronomic traits and genetic diversity analysis results were studied to screen the excellent sour jujube germplasm resources.[Method] 15 agronomic traits of 86 sour jujube germplasm resources were identified，and 9 intersimple sequence repeat （ISSR） primers were used for genetic diversity analysis.[Result] Through the comprehensive evaluation of 15 agronomic traits，5 excellent germplasm resources were selected from 86 sour jujube individuals.A total of 20 polymorphic bands were amplified by 9 ISSR primers.The polymorphism information content （PIC） ranged from 0.60 to 0.81 with an average of 0.70.Clustering analysis showed that the 86 sour jujube germplasm resources could be divided into 2 groups at the genetic similarity coefficient of 0.57，79 sour jujube individuals were grouped into class A and 7 sour jujube individuals were grouped into class B.[Conclusion] This study provides a useful basis for the classification，identification and variety selection of sour jujube germplasm resources.

Key words Sour jujube;Agronomic traits;ISSR;Genetic diversity

基金项目 河南省自然科学基金项目（162300410198）;河南省科技开放合作计划项目（172106000049）。

作者簡介 李世鹏（1986—），男，河南开封人，讲师，博士，从事枣树遗传育种研究。*通信作者，教授，硕士，从事林木育种研究。

收稿日期 2018-12-07

酸枣（Z.acidojujuba C.Y.Cheng et M.J.Liu）为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus Mill）植物，原产于我国，主要分布于我国北方各省，多生长于丘陵、山区[1-2]。 酸枣是栽培枣的原始野生种，具有耐旱、耐寒、耐碱等特点，是栽培枣最主要的砧木[3-5]。酸枣仁具有较高的药用价值，味酸、性平，具有补肝宁心、镇静安神、敛汗、生津等功效，是一种药食同源食品[6]。《神农本草经》中记载酸枣能够治疗“心腹寒热，邪结气聚，四肢酸痛湿痹”，可以起到“安五脏，轻身延年”的作用。现代药理研究表明，酸枣仁含有皂苷、黄酮、生物碱和脂肪酸等多种活性物质[7-12]。

酸枣类型众多，种植资源丰富。杨雷[13]对149份酸枣种质资源的生物学性状和营养成分进行了系统分析，从中筛选出10份可用于鲜食、加工用的种质资源。孙亚强等[14]对60份酸枣资源的7个果实表型性状和13个品质性状进行相关性分析。结果表明，酸枣主要农艺性状遗传变异丰富能够为枣树育种提供优良的亲本材料和嫁接砧木。随着分子生物技术的发展，人们开始利用分子标记对酸枣的遗传多样性进行研究。张春梅[15]利用双抑制PCR技术开发了10对酸枣SSR多态性引物，并对43份酸枣材料进行了遗传多样性分析。张鹏飞等[16]利用7个SSR标记对16份枣品种和17份酸枣材料的遗传多样性进行分析。结果表明，酸枣的遗传多样性高于枣，酸枣与枣之间基因交流比较频繁。

ISSR（intersimple sequence repeat）简单序列重复技术是一种基于微卫星序列的分子标记，以16～25 bp的重复序列作为引物扩增相邻反向重复序列之间的区域[17]。ISSR具有操作简便、无需预知基因组序列、引物多态性高等特点，是研究遗传多样性、系统发育和进化生物学的一种快速、简单且廉价的方法[18]。枣基因组包含高密度简单序列重复序列[19]，因此非常适合使用ISSR标记进行遗传多样性分析。笔者对收集的86份酸枣种质资源的单果重、可食率、果实风味等15个主要果实性状进行分析，并利用ISSR标记进行遗传多样性分析，旨在为酸枣种质资源创新、新品种选育和分子标记辅助育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 86份酸枣种质资源收集于新疆、河南、山西等地区，于2016年嫁接到洛阳师范学院枣树种质资源圃。供试材料编号为US01～86。

1.2 试验方法

1.2.1 果实性状调查。

2017年9月下旬至10月上旬收集各供试材料脆熟期枣果用于表型性状调查。调查果实性状包括单果重、果实纵径、果实横径、果形指数、单核重、果核纵径、果核横径、果核指数和可食率9个果实品质性状;果肉质地、粗细、风味、汁液和异味5个感官性状。各性状调查标准参照《枣种质资源描述规范和数据标准》[20]。

1.2.2 DNA提取与检测。

2017年5月中旬采集各供试材料的幼嫩叶片1～2 g，采用CTAB法[21]提取基因组总DNA。用NanoDrop2000检测DNA质量，并稀释至50 ng/μL。

1.2.3 ISSR引物合成与分析。

根据British Columbia大学公布的100条ISSR引物，由华大基因公司合成。PCR反应体系（10 μL）：2.0 μL基因组DNA，0.4 μL引物（10 μmol/L），0.8 μL dNTP （2.5 mmol/L），1.0 μL 10×Buffer，0.2 μL Taq DNA Polymerase （Solarbio公司）和 5.6 μL ddH2O。ISSR扩增在Applied Biosystems公司2720 Thermal Cycler型PCR仪上进行。ISSR 扩增程序：94 ℃预变性 3 min，然后94 ℃变性30 s，50/55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min， 35个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳分离，在凝胶成像分析仪（BIORADGEIDOCXR+）下拍照。

1.3 数据分析

根据ISSR扩增产物在琼脂糖凝胶上的相对位置，对多态性条带进行记录，分别以“1”和“0”表示同一位置条带的有无，建立原始数据，用NTSYSpc 2.10e软件进行聚类分析[22]。

ISSR位点的多态性信息量（polymorphism information content，PIC）按如下计算公式进行计算： PIC=1-Pi2，式中，Pi 表示第i个等位位点出现的频率[23]。

2 结果与分析

2.1 酸枣资源果实品质性状分析

对收集的86份酸枣资源的单果重、果实纵径、果实横径、果形指数、单核重、果核纵径、果核横径、果核指数和可食率9个重要果实性状进行分析（图1）。结果表明，单果重变异系数最高，为42.09%，变异范围为0.99～11.37 g;单核重变异系数次之，为27.66%，变异范围为0.19～0.87 g。可食率的变异系数最小，为491%，变异范围为69.95%～95.00%。其他果实品质性状的变异系数在10.81%～19.10%（表1）。

47卷11期李世鹏等 86份酸枣种质资源筛选和遗传多样性分析

通过分析果肉质地、粗细、风味、汁液和异味5个感官性状对上述种质资源进行口感综合评价。结果表明，果肉质地以致密为主，其中较致密和致密型所占比例分别为43.0%和24.4%。果肉粗细以中等为主，所占比例为62.8%。果肉汁液以中等或偏少为主，汁液较多的种质仅占3.5%。果实风味以酸、酸甜为主，风味较好的甜酸型占19.8%，未发现甜型的酸枣材料。少部分酸枣（20.9%）存在苦味或青草味等异味（表2）。

上述结果表明，酸枣种质资源遗传变异丰富，综合上述9个果实品质性状和5个口感性状，从中筛选出5份大果型、可食率高、口感好的优良种质资源（表3）。

2.2 酸枣种质资源遗传多样性分析

为了进一步研究酸枣种质资源的遗传多样性，利用ISSR标记对86份酸枣种质资源的遗传变异和亲缘关系进行研究。利用12份酸枣种质资源对100个ISSR引物进行扩增，从中筛选出25个能扩增出多态性条带的引物（图2）。根据扩增效果，从中选出9个多态性和重复性好的引物用于86份酸枣种质资源的分析（表4）。9个引物在86份种质中共扩增出29条带，其中多态性条带为20条，占总条带数的69%。每个引物扩增出的条带数为2～5条，平均条带数为3.2条。每个引物具有多态性条带2～3条，平均多态性条带数为2.2条。各引物PIC值为060～0.81，平均值为0.70。

基于9对ISSR引物的扩增结果，对86份酸枣种质资源进行遗传多样性分析。由图3可知，86份种质资源在遗传系数0.57的水平上被分为两大类。A类包括79份种质资源，B类包括剩余的7份种质资源。A类种质资源在遗传系数0.62的水平上进一步被分为4个亚类：A-1包括37份种质资源，A-2包括38份种质资源，A-3和A-4分别包括3份和1份种质资源。B类种质资源在遗传系数0.59的水平上被进一步分为2个亚类，B-1和B-2分别包括5份和2份种质资源。5份优良种质资源中US60属于A-1亚类，US40、US51和US86属于A-2亚类，US73属于B-1亚类，遗传系数在0.56～0.80。

Note：M.D2000 plus DNA Ladder

3 结论与讨论

酸枣多为灌木或小乔木，抗逆性极强，且酸枣仁具有较高的药用价值[24]。武媛林[25]对62份酸枣种质资源的果实性状、营养成分及其种仁的生物学性状、药用成分含量等进行了系统分析，将酸枣分为适合于鲜食、药用、鲜食药用兼用3种类型。王僧虎等[26]从邢台山区的野生酸枣资源中选育出一个优良加工制汁、药用酸枣新品种邢州1号。邢州1号质地致密、较脆、汁液适中、味酸甜，平均单果重3.0 g，可食率81.2%。王春桐[27]从山东济南南部山区野生酸枣资源中筛选出一个极早熟鲜食新品种‘脆酸枣。该品种肉质致密、脆、汁液多、酸甜适口，单果重6.1 g，可食率87%。张建英等[28]从野生酸枣中筛选到2个优良酸枣鲜食品种：‘蓝猫1号和‘蓝猫2号。2个品种单果重为4.86和4.78 g，可食率均为89%。上述研究筛选到的酸枣品种与枣树主要栽培种相比果实较小、可食率较低[25-28]。该研究从86份酸枣种质资源中篩选出5份优良鲜食酸枣种质资源。其中，US86单果重达11.17 g，可食率为95%，这说明酸枣优良品种选育仍有较大的潜力。

酸枣分布广泛、表型变异丰富，目前酸枣新品种的选育主要依靠形态学鉴定。利用分子标记构建酸枣种质资源的指纹图谱有助于酸枣种质资源的鉴定。根据25个ISSR引物的扩增结果，选择PIC值最高的4个引物JISSR11、JISSR25、JISSR43和JISSR47可以鉴定出63份酸枣种质资源。这些特异性条带可以作为酸枣种质资源鉴定和新品种选育的分子依据。

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