乳酸对卵清蛋白抑菌活性的增效作用

孙雅静,陈 倩,顾丽红,徐焕焕,张 璟,郭爱玲,2,*

(1.华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070;2.国家蛋品加工技术研发分中心,湖北武汉 430070)

卵清蛋白作为禽蛋蛋清中的主要蛋白质(54%)[1],具有来源广泛、制备容易、价格低廉等优点,是开发新型天然生物抑菌剂的重要资源。长期以来,对卵清蛋白的研究多集中于结构、抗氧化性、功能特性等方面[2-3],主要通过酶解或化学改性的方式来增强卵清蛋白的抑菌活性[4-6],这些方法在增强卵清蛋白抑菌活性的同时增大了制备成本,不利于卵清蛋白在抑菌领域的广泛应用。因此,开发一种能够经济有效增强卵清蛋白抑菌活性的方法非常必要。

作为食品添加剂的乳酸或天然发酵产品中的乳酸被认为是一种安全的天然生物防腐剂[7]。乳酸便宜且环保,能够抑制多种类型食物腐败细菌的生长,包括肠杆菌科和假单胞菌科的革兰氏阴性菌[8-13]。乳酸的抑菌分子机制主要包括降低pH、细胞膜透化、提高渗透压、抑制大分子合成以及诱导抗菌肽产生等,其中乳酸进入细胞内使细胞内pH降低是乳酸主要的作用方式[14]。

但目前乳酸在食品中的使用浓度有一定限制,无法直接添加大量乳酸作为杀菌剂应用,Alakomi[15]发现,高浓度乳酸的抗菌作用在很大程度上(但不完全)归因于其以未解离形式穿透细胞质膜的能力,导致细胞内pH的降低和跨膜质子动力的破坏,而在低浓度如最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)或亚致死浓度下,可作为革兰氏阴性细菌外膜的透化剂以及作为其他抗菌物质的增效剂。庞文聪等[16]将二氢杨梅素与乳酸协同抑制副溶血弧菌,发现当添加1%的乳酸后,抑菌圈直径由原来的10.7 mm增大至19.3 mm,表明乳酸明显增强了二氢杨梅素对副溶血弧菌的抑菌活性。因此,采用低浓度的乳酸作为渗透剂,将食品级渗透剂与其他抗菌剂结合使用将是抑制食品材料中腐败菌和病原菌的新思路。

本试验通过乳酸处理大肠杆菌O157∶H7、金黄色葡萄球菌2种常见致病菌和灿烂类芽胞杆菌、土变形杆菌2种腐败菌,研究了不同浓度、不同温度和不同乳酸处理时间对卵清蛋白抑菌活性的影响,并研究了在最佳乳酸处理条件下,乳酸处理前、后对卵清蛋白抑菌活性的增加率及抑菌动力学曲线，以期为卵清蛋白这种禽蛋中的天然食品成分在抑菌领域的应用奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌(Escherichiacoli)O157∶H7 ATCC 51659 武汉市疾病预防控制中心;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC 21600 中国工业微生物菌种保藏中心;灿烂类芽胞杆菌(Paenibacilluslautus)、土变形杆菌(Proteusterrae) 由本实验室从鸡蛋中分离得到;乳酸 国药集团化学试剂有限公司;卵清蛋白 Biosharp公司;营养琼脂(NA)、营养肉汤(LB)培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司;其他试剂均为分析纯。

SHP-250型生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司;UV-1700型紫外可见分光光度计 Shimadzu;5415-R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;TECAN帝肯Infinite M200 Pro NanoQuant酶标仪 北京东胜创新生物科技有限公司;pH计 杭州联测自动化检测有限公司;HH-2恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌培养 从平板上挑取一个单菌落接种于LB肉汤中,37 ℃摇床培养16～18 h,离心取菌体,经无菌生理盐水稀释至菌浓度为107CFU/mL,以平板计数法测定其具体菌浓度。

1.2.2 乳酸及卵清蛋白溶液的制备 使用PBS(10 mmol/L,pH7.4)为溶剂分别配制10%的乳酸储备溶液和25.6 mg/mL卵清蛋白储备液,经0.22、0.45 μm细菌过滤器过滤除菌,4 ℃冷藏保存。

1.2.3 乳酸和卵清蛋白最小抑菌浓度测定 采用微量肉汤稀释法[17]测定抑菌剂的最小抑菌浓度(MIC),即先向96孔板的各孔加入100 μL无菌LB肉汤,再向每一排第一孔加入100 μL抑菌剂,用枪头充分吹打混匀后吸取100 μL至第2孔,依次二倍系列稀释至同一排的第11孔,第11孔混匀后吸取100 μL弃去。然后向每排的1～10孔和第12孔加入100 μL经生理盐水稀释的菌液(约105CFU/mL),第11孔加入100 μL生理盐水。将板置于37 ℃恒温培养箱中静置培养24 h。以阴性对照孔(12孔)全部浑浊,阳性对照孔(11孔)全部清亮视为结果有效。使用酶标仪测定各孔的OD600,全抑制的孔所对应的最小抑菌剂浓度即为该抑菌剂对该菌的MIC。

1.2.4 不同乳酸处理条件对抑菌活性的影响

1.2.4.1 乳酸处理浓度的影响 依据1.2.3实验结果得到乳酸对各测试细菌的MIC值,对每种细菌选取了三个乳酸浓度(表1),考察亚致死剂量下(低于MIC值),不同浓度的乳酸处理对卵清蛋白抑菌活性的影响。

测试组1(不同浓度乳酸+卵清蛋白):将培养至对数期的菌液在4 ℃、3500 r/min离心10 min,收集沉淀,用弃去上清液等体积的不同浓度(表1)的乳酸重悬,室温静置处理30 min,在相同条件下再次离心,弃去上清液,沉淀用PBS(10 mmol/L,pH7.4)洗涤2次后重悬于PBS中。然后取100 μL该悬浮液到96孔板中,各孔中已含有100 μL 卵清蛋白溶液(用LB肉汤稀释,浓度6.4 mg/mL)。

表1 处理不同细菌使用的乳酸浓度

测试组2(不同浓度乳酸):取100 μL用不同浓度(表1)乳酸处理后的菌悬液加入到含有100 μL空白肉汤(不含卵清蛋白)的孔中。

测试组3(卵清蛋白):取100 μL经PBS处理过的菌液加入到含有100 μL卵清蛋白溶液的孔中。

对照组:取100 μL经PBS处理过的菌液加入到含有100 μL空白肉汤(不含抑菌剂)的孔中,此组的OD600记为A0。

将板在桌上轻轻振荡混匀后放入37 ℃培养箱中培养16 h,使用酶标仪测定各孔的OD600,通过公式(1)[17]计算抑菌剂的抑菌活性,以测试组为横坐标,其各自对应的抑菌活性为纵坐标,确定乳酸处理浓度对卵清蛋白抑菌活性的影响。

式(1)

其中:U为抑菌活性,U;A0为对照组的吸光度;A为测试组的吸光度。

1.2.4.2 乳酸处理时间的影响 按照1.2.4.1所述操作进行乳酸处理,乳酸使用浓度:对灿烂类芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为0.05%、对大肠杆菌O157∶H7为0.20%、对土变形杆菌为0.15%,室温静置处理10、20、30、40、60、90和120 min后,后续操作同1.2.4.1节。

1.2.4.3 乳酸处理温度的影响 实验步骤同1.2.4.1所述,乳酸浓度同1.2.4.2,分别在4、25、30、37、40和50 ℃下静置处理40 min。

1.2.5 最佳乳酸处理条件下对卵清蛋白抑菌活性的影响 按照表2乳酸对各测试菌的最佳处理条件对细菌进行乳酸处理,实验步骤同1.2.4.1。乳酸处理前后卵清蛋白抑菌活性的增加率见式(2)。

表2 乳酸对各测试菌的最佳处理条件

增加率(%)=(处理后活性-处理前活性)×100/增效前活性

式(2)

1.2.6 乳酸处理前后卵清蛋白的抑菌动力实验 将菌隔夜培养至对数期(16～18 h),离心,菌体经乳酸处理后用PBS重悬,使最终菌浓度达107CFU/mL,取100 μL菌悬液于96孔板中,加入100 μL 不同浓度(6.4、1.6、0.4 mg/mL)的卵清蛋白溶液,混匀后,于37 ℃、150 r/min培养24 h,分别在 0、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24 h测定各孔的OD600,以单独使用乳酸和单独使用卵清蛋白为试验组对照,以没有任何抑菌剂处理作为生长对照组。然后以培养时间(h)为横坐标,各时间点测得的OD600为纵坐标,绘制抑菌动力学曲线。

1.3 数据处理

上述所有实验均重复3次,用SPSS 22.0软件对数据进行差异显著性分析(p=0.05),用Origin 8.5软件进行数据分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 乳酸和卵清蛋白的抑菌活性

通过微量肉汤稀释法测定乳酸和卵清蛋白对测试菌株的最小抑菌浓度(MIC)如表3所示。

表3 乳酸和卵清蛋白对测试菌的最小抑菌浓度(MIC)

注：G+表示革兰氏阳性菌，G-表示革兰氏阴性菌。

乳酸对测试菌的MIC分别为灿烂类芽胞杆菌0.0781%、金黄色葡萄球菌0.1172%、土变形杆菌0.1563%、大肠杆菌O157∶H7 0.3125%,表明乳酸对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抑菌活性,且对革兰氏阳性菌的抑菌活性明显强于革兰氏阴性菌。

卵清蛋白对测试的2种革兰氏阳性菌的MIC分别为0.4 mg/mL(灿烂类芽胞杆菌)和6.4 mg/mL(金黄色葡萄球菌),对于测试的革兰氏阴性菌,在给定的最大卵清蛋白浓度作用下,其生长仍不能受到有效抑制,表明卵清蛋白主要可以抑制革兰氏阳性菌,且对灿烂类芽胞杆菌的抑菌活性远远强于金黄色葡萄球菌,但其对于革兰氏阴性菌抑菌活性不强(可能需要较高的浓度)。

2.2 乳酸预处理后卵清蛋白的抑菌活性

2.2.1 不同浓度乳酸处理后卵清蛋白的抑菌活性 从图1中可以看出乳酸对卵清蛋白增效作用的强弱在不同测试菌株之间存在差异,不同细菌对乳酸的敏感性不同,乳酸的最佳作用浓度存在较大差异。由图1可知，0.05%浓度的乳酸可以较好地增加卵清蛋白对灿烂类芽胞杆菌(图1A)和金黄色葡萄球菌(图1B)的抑菌活性;对于土变形杆菌(图1C),宜选择0.15%的乳酸浓度;对于大肠杆菌O157∶H7(图1D),0.2%浓度的乳酸可以最大幅度地增强卵清蛋白的抑菌活性。经乳酸处理后,卵清蛋白对两种革兰氏阴性菌抑菌活性的增大幅度明显大于对两种革兰氏阳性菌。表明乳酸更加显著地增加了卵清蛋白对革兰氏阴性菌的抑菌活性(p<0.05)。

图1 乳酸处理浓度对卵清蛋白抑菌活性的影响

2.2.2 乳酸处理不同时间后卵清蛋白的抑菌活性 由图2可以看出,灿烂类芽胞杆菌、土变形杆菌和大肠杆菌O157∶H7,乳酸处理10 min即可增强卵清蛋白的抑菌活性(表现为10 min处的抑菌活性高于0 min),处理40 min可以最大限度地增强卵清蛋白的抑菌活性;而对于金黄色葡萄球菌需要乳酸处理30 min以上才能增强卵清蛋白的抑菌活性(30 min处的抑菌活高于0 min),处理60 min才能最大限度地增强卵清蛋白的抑菌活性。

图2 乳酸处理时间对卵清蛋白抑菌活性的影响

这可能是由于不同细菌的细胞壁肽聚糖结构不同,大多数的革兰氏阴性菌以及部分芽胞杆菌的肽聚糖合成路径为二氨基庚二酸(DAP)型,此种类型的肽聚糖层短肽之间是直接交联的,形成的肽聚糖层相对稀疏;而葡萄球菌的肽聚糖合成路径为赖氨酸(Lys)型,短肽间需要肽桥连接,合成的肽聚糖厚且致密[18-19]。因此,乳酸分子进入金黄色葡萄球菌细胞膜内部的过程较慢,从而其起细胞透化作用所需的时间较长。在乳酸处理60 min以内,卵清蛋白的抑菌活性随处理时间的增加逐渐上升;当乳酸处理超过60 min时,卵清蛋白对大部分菌株的抑菌活性下降,可能是由于细菌对外界环境具有适应能力。

2.2.3 不同乳酸处理温度对卵清蛋白抑菌活性的影响 由图3可以看出,乳酸处理温度对卵清蛋白抑菌活性的影响在不同菌株之间存在差异。

对于革兰氏阳性菌(图3A和3B),在4 ℃下进行乳酸处理时,卵清蛋白对细菌的抑菌活性最强;对于革兰氏阴性菌(图3C和3D),在25 ℃(室温)下进行乳酸处理可以较好地增强卵清蛋白的抑菌活性;对于四种致病微生物,在25 ℃下进行乳酸处理均可以起到较强的抑菌作用。在30、40和50 ℃下进行乳酸处理,对卵清蛋白抑菌活性的增效作用均不理想,可能是因为温度升高使乳酸的解离程度增大,从而使可以进入细胞的未解离的乳酸小分子的量减少,造成乳酸的透化作用降低,对卵清蛋白抑菌活性的增效作用降低。而37 ℃下乳酸处理对卵清蛋白抑菌活性增效明显则可能是由于37 ℃为细菌的最适生长温度,此环境下细菌对外界环境敏感,有助于乳酸的透化作用。

图3 乳酸处理温度对卵清蛋白抑菌活性的影响

不同细菌的最适生长温度不同,对温度的敏感性也不同;另一方面,温度与乳酸的解离程度和乳酸溶液的pH有关,因此,乳酸处理温度对菌株生理特性的影响是多因素共同作用的结果,是一个复杂的过程。

2.3 最佳乳酸处理条件下卵清蛋白的抑菌活性增加率及显著性分析

当在各自的最佳条件下进行乳酸处理后,卵清蛋白(6.4 mg/mL)对四种致病菌的抑菌活性与未经乳酸处理时的抑菌活性对比如表4所示,从表4中可以看出乳酸将卵清蛋白对灿烂类芽胞杆菌的抑菌活性从原来的0.8113增加到0.8746,增效了7.802%;将卵清蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌活性增效了26.904%;对于土变形杆菌,卵清蛋白的抑菌活性由原来的0.5862增长为0.9014,活性增长53.770%;对大肠杆菌O157∶H7,乳酸将卵清蛋白的活性增长了131.321%(由0.3148到 0.7282)。这些结果表明使用亚致死浓度的乳酸处理细菌可以极显著增强细菌对卵清蛋白的敏感性(p<0.01),从而有效地增强了卵清蛋白的抑菌活性,尤其是大大增强了卵清蛋白对革兰氏阴性菌的活性。

表4 乳酸处理前后卵清蛋白抑菌活性变化及显著性分析表

2.4 乳酸处理前后卵清蛋白的抑菌动力学曲线

图4A～D分别为乳酸处理前后卵清蛋白对四种测试菌的抑菌动力学曲线。如图4A灿烂类芽胞杆菌,由于乳酸处理对其造成亚损伤,在长达16 h内都生长不良,但16 h后恢复生长且生长速度很快。卵清蛋白对该菌的MIC为0.4 mg/mL,浓度大于0.4 mg/mL的卵清蛋白单独作用可完全抑制细菌生长长达24 h。MIC浓度下的卵清蛋白单独作用,细菌在8 h后由于环境适应性开始生长,但生长速度十分缓慢。经乳酸处理后,使用MIC浓度的卵清蛋白即可完全抑制细菌生长长达24 h。表明MIC浓度的卵清蛋白单独作用只能抑制或减缓细菌的生长,而经乳酸处理细菌后,MIC浓度的卵清蛋白可起到杀菌作用。这也暗示了乳酸对细菌的亚损伤可能是增效卵清蛋白抑菌活性的方式之一。乳酸增效后降低了卵清蛋白的使用浓度并延长了抑菌时间。

如图4B金黄色葡萄球菌,卵清蛋白的MIC为6.4 mg/mL,单独使用6.4 mg/mL的卵清蛋白可以有效抑制金黄色葡萄球菌的生长速度,而经乳酸增效后,MIC浓度的卵清蛋白则可以将原有的菌数量减少至更低(OD值下降),表明乳酸处理金黄色葡萄球菌后,MIC浓度的卵清蛋白可以起到杀菌作用,且具有较好的时效性,可以在24 h内完全抑制其生长。对于其余浓度的卵清蛋白(1.6和0.4 mg/mL),经乳酸增效后,抑菌趋势与单独使用乳酸处理获得的趋势相同,表明乳酸对卵清蛋白的增效作用,一方面与卵清蛋白的浓度有关,另一方面与乳酸本身对细菌的损伤情况有关。

如图4C土变形杆菌,乳酸处理后细菌由于受到亚损伤，与生长对照相比生长缓慢。之前的研究表明6.4 mg/mL的卵清蛋白对其的抑菌活性为0.5单位左右,表明卵清蛋白本身对土变形杆菌有一定的抑制作用,但是活性不强,从图4C中可以看出,6.4 mg/mL的卵清蛋白的确可以减缓该菌的生长速度,但减缓幅度低于亚致死浓度乳酸的作用效果,表明卵清蛋白的这种抑制甚至无法起到对细菌的亚致死作用,作用并不强。乳酸增效后,6.4 mg/mL的卵清蛋白可以明显抑制该菌生长,此时的抑菌强度强于亚致死剂量乳酸的抑菌作用。另外,其他浓度的卵清蛋白对该菌无明显的生长抑制作用,即使经乳酸增效,获得的抑菌趋势与单独使用乳酸处理时的趋势相同,表明乳酸的增效作用可能取决于某浓度下的卵清蛋白本身是否对这种细菌具有一定的抑制作用(即使轻微抑制)。

图4 乳酸处理前后不同浓度的卵清蛋白对四种测试菌的抑菌动力学曲线

如图4D大肠杆菌O157∶H7,之前的研究表明6.4 mg/mL的卵清蛋白本身对其的抑菌活性在0.3单位左右,表明该浓度下的卵清蛋白对其具有较弱的抑菌活性,乳酸增效的结果与针对土变形杆菌的相似。即乳酸处理可以显著增强6.4 mg/mL的卵清蛋白对大肠杆菌O157∶H7的抑菌效果,因为6.4 mg/mL的卵清蛋白本身对大肠杆菌O157∶H7有一定的抑制效果,这再次验证了之前的推测:乳酸的增效作用取决于某浓度下的卵清蛋白本身是否对细菌有一定的抑制作用。

3 结论

通过研究乳酸浓度、乳酸处理时间和处理温度等因素对卵清蛋白活性的影响,确定了使用0.05%的乳酸在4 ℃下处理40 min可以将卵清蛋白对灿烂类芽胞杆菌的抑菌活性增加7.802%;对金黄色葡萄球菌,用0.05%浓度的乳酸在4 ℃下处理60 min可将卵清蛋白的抑菌活性增大26.904%;在25 ℃下,使用0.15%和0.2%的乳酸分别处理土变形杆菌和大肠杆菌O157∶H7 40 min,卵清蛋白的抑菌活性分别增加53.770%和131.321%。抑菌动力学曲线表明，乳酸对卵清蛋白的抑菌活性的增效不仅表现在抑菌活性方面,还显著降低了卵清蛋白的使用浓度(p<0.05)，并延长了卵清蛋白的抑菌时间。

目前关于乳酸增效天然生物抑菌剂的研究较少,且本研究中使用的乳酸浓度低于大多数研究中报道的抑菌浓度[13,16],使用的卵清蛋白是禽蛋中存在的成分,来源广泛、价格低廉且天然安全无毒,具有较好的经济实用性。试验结果表明，添加低浓度的乳酸处理细菌可以极显著增加(p<0.01)卵清蛋白对测试菌的抑菌活性,尤其是针对革兰氏阴性菌,表明将食品级渗透剂如低浓度乳酸与抗菌剂(如卵清蛋白)结合使用的试验方案有望应用于食品的防腐、清洗或保鲜等领域,应用前景广阔。