板栗糯米清酒中氨基酸分析及其抗氧化活性

葛祎楠,李 斌,常学东,邹 静,*

(1.河北科技师范学院食品科技学院,河北昌黎 066600;2.河北省板栗工程技术中心,河北昌黎 066600;3.河北省板栗产业协同创新中心,河北秦皇岛 066000;4.河北省(承德)板栗产业技术研究院,河北承德 067000)

板栗(Castaneamollissima)是壳斗科栗属植物,广泛种植于我国山区。板栗营养丰富,享有“干果之王”的美誉[1-3]。板栗除了富含糖类、不饱和脂肪酸[4]、维生素和微量元素外[5],还富含鞣花酸等多酚类物质,具有较好的抗氧化活性及保健作用[6]。板栗虽然营养丰富,但是因为其不耐贮藏[7],导致每年板栗在贮藏过程中损失量高达50%[8],造成了极大的经济损失。因此在研究板栗贮藏方法的同时[7,9-11],也应该大力发展多种板栗深加工途径,以减少板栗的贮藏量。

由于板栗富含淀粉和可溶性糖,因此可将其作为酿酒原料。为了更好的保留板栗中的营养物质,开发板栗酿造酒是较为合理的方法之一。清酒是酿造酒的代表之一,虽然不同等级清酒的口感及香气差异较大,但总体而言,清酒口感柔和顺滑、香气淡雅、不能有明显的 “曲味”[12],易与多种菜肴配伍。

目前有关板栗酿造酒的报道主要集中于板栗淀粉的糖化工艺,如王琳等[13]以板栗和糯米为原料,加入甜酒曲,液态发酵得到香气浓郁的板栗酒,并对香气进行了测定。王蔚新等[14]利用酶制剂对板栗淀粉进行水解。葛祎楠[15-16]等对酿造糖化曲种进行了选择并对发酵工艺进行了优化。本文主要对板栗糯米清酒的氨基酸种类与含量,板栗糯米清酒的抗氧化能力进行研究,为板栗糯米清酒的开发以及市场化提供了理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大米 吉林龙羲米业有限公司;燕龙板栗 河北迁安;米曲霉(Aspergillusoryzae)2011 中国工业微生物菌种保藏中心;清酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 实验室保藏菌种;DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基,纯度≥98%)、BHA(丁基羟基茴香醚,纯度≥98%)、Ferrozine(菲洛嗪,纯度≥97%)、生育酚(纯度≥96%) Sigma公司;其他试剂 均为国产分析纯。

V1800型可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;日立L-8900型氨基酸自动分析仪 天美(中国)科学仪器有限公司;1.75 L发酵缸 景德镇洛萨陶瓷有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米曲的制备 称取大米20 g,洗净后,浸泡24 h,淋干,装入250 mL三角瓶,121 ℃灭菌20 min。灭菌后,冷却到20 ℃,以无菌操作接种米曲霉(接种量为4%,以干大米质量计),充分摇匀后,34 ℃恒温培养,24 h后摇动一次,在培养48 h,米曲成熟。

1.2.2 酵母的活化 无菌操作下接种酵母菌于米曲汁培养基,28 ℃、110 r/min培养12 h,扩培后的酵母菌细胞数达到1×106～2×106个/mL。

1.2.3 工艺流程及操作要点

1.2.3.1 酿造工艺流程

糯米清酒工艺流程同上,但不添加板栗。

1.2.3.2 操作要点 板栗去壳去衣后清洗;糯米清洗并浸泡12 h后沥干水分。生板栗与糯米添加比例为1∶3混合、蒸煮、晾凉后按15%的比例加入米曲,装缸,搭窝,28 ℃恒温发酵,1 d后,按0.2%(以糯米质量计)接种量添加酵母,28 ℃发酵1 d后,以1∶1.9(以糯米质量计)比例加入水(用乳酸调节pH至4.2),25 ℃发酵8 d。从第3 d起,每天搅拌1次,到第9 d停止搅拌,18 ℃密闭发酵20 d。然后压榨、粗滤、错流过滤后,12 ℃陈酿9个月,最后再过滤、杀菌。

1.2.4 氨基酸组分的测定 板栗清酒中氨基酸组分测定参照GB5009.124-2016[17]。吸取酒样10 mL,置于50 mL容量瓶中,加入5%三氯乙酸20 mL,摇匀,加水稀释至刻度,摇匀,于微孔漏斗上过滤,吸取滤液,直接装样于氨基酸自动分析仪上,测定除色氨酸外的其它17种氨基酸的含量。糯米清酒测定方法同上,并计算两种清酒中氨基酸增加倍数。

氨基酸增加倍数=板栗糯米酒氨基酸含量/糯米清酒氨基酸含量

1.2.5 总酚含量的测定 酒中总酚含量的测定采用福林-肖卡比色法[18]。

标准曲线的制作:使用微量移液器,分别吸取250 μL浓度为0、50、100、150、250和500 mg/L没食子酸标准溶液,加入12.5 mL蒸馏水、1250 μL福林肖卡显色剂、5 mL 20%碳酸钠溶液,显色1 h后,于765 nm波长下测定其吸光度,并绘制标准曲线。

酒样总酚含量的测定:以250 μL酒样代替没食子酸标准溶液,测定方法同上。

1.2.6 亚油酸体系抗氧化性的测定 参考Gǜlc等[19]的检测方法并进行改进。取310 μL亚油酸和350 mL吐温-20,加入磷酸钾缓冲液(0.04 mol/L,pH7.0),定容至50 mL,均质制备亚油酸乳状液。取磷酸钾缓冲液(0.04 mol/L,pH7.0)2.5 mL、一定体积的板栗糯米清酒(50、100、200 μL)、2.5 mL亚油酸乳状液,混匀,37 ℃避光培养5 d。每12 h准确量取上述100 μL混合溶液,加入4.7 mL 75%乙醇、100 μL 30%硫氰酸铵溶液和100 μL FeCl2(20 mmol/L,溶于3.5% HCl中),准确反应4 min,在500 nm处测得吸光度,并计算第10次的样品的抑制率。糯米清酒测定方法同上。以蒸馏水代替酒样为空白对照,1 g/L BHT、BHA和生育酚作阳性对照。

抑制率(%)=(1-A1/A0)×100

式中,A0为空白吸光度,A1为加入样品吸光度。

1.2.7 还原力的测定 参考Siddhuraju等[20]方法并进行改进。取一定体积的板栗糯米清酒(50、100、150、200 μL),加入1 mL蒸馏水、2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L,pH6.6),混匀后,加入1%铁氰化钾溶液2.5 mL,50 ℃水浴20 min,急速冷却后,加入2 mL 10%三氯乙酸溶液,5000 r/min离心15 min,取5 mL上层清液,加入5 mL蒸馏水、1 mL 0.1%氯化亚铁溶液,在700 nm处测定吸光度。糯米清酒测定方法同上。以蒸馏水调零,以1 g/L BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)和抗坏血酸为阳性对照。

1.2.8 金属螯合能力的测定 参考Wang等[21]的方法进行改进,取一定体积的板栗糯米清酒(0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL)板栗糯米清酒于蒸馏水中,配制总体积为4.7 mL的样品水溶液,然后加入0.1 mL 2 mmol/L氯化亚铁溶液和0.2 mL 5 mmol/L Ferrozine,25 ℃反应20 min。在562 nm处测吸光度。糯米清酒测定方法同上。以蒸馏水代替酒样为空白对照,以1 g/L EDTA(乙二胺四乙酸)和柠檬酸为阳性对照。

鳌合率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A0为空白吸光度,A1为加入样品吸光度,A2为蒸馏水代替菲啰嗪溶液的吸光度

1.2.9 DPPH自由基清除能力的测定 参考Concepción等[22]的方法。吸取一定体积的板栗糯米清酒(50、100、150、200 μL),配制总体积为2 mL的样品水溶液,加入2 mL 0.01% DPPH乙醇溶液,摇匀,30 ℃水浴恒温30 min,在517 nm下测定吸光度。糯米清酒测定方法同上。以蒸馏水代替酒样为空白对照,以1 g/L BHT和抗坏血酸为阳性对照。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1加入样品吸光度,A2为无水乙醇代替DPPH溶液的吸光度,A0为蒸馏水代替样品溶液的吸光度。

1.3 数据处理

每组试验3组平行实验,采用Excel软件处理实验数据并计算结果。

2 结果与分析

2.1 氨基酸组分分析

氨基酸是人体必需的营养物质,也是酒中重要的风味物质。用相同的曲种及酿造工艺分别酿造了糯米清酒和板栗糯米清酒,用氨基酸测定仪分别测定了两款酒中氨基酸的种类及含量,平行测定3次酒样后,取均值,结果见表1。

表1 糯米酒和板栗糯米清酒中氨基酸种类及含量

板栗中含蛋白质 5%～11%,含量高于稻米,并且赖氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苏氨酸,缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等氨基酸的含量超过 FAO/WHO的标准。从表1可以看出,板栗糯米清酒富含17种氨基酸。相同工艺条件下,以板栗作为主要原料之一,可以明显增加板栗糯米清酒中氨基酸含量,其中天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量是纯米清酒中的二倍以上。因此板栗的添加对酒体中氨基酸的种类没有影响,只改变了酒体中的各种氨基酸的含量。

2.2 板栗糯米清酒抗氧化性研究

2.2.1 总酚含量 酚类物质是较强的体外抗氧化剂。采用福林-肖卡法测定清酒中的总酚含量,并以没食子酸计。

由图1可知,建立的标曲方程为Y=0.0012X+0.0598,决定系数R2为0.9977,表明没食子酸浓度与检测响应值呈良好的线性关系。

图1 没食子酸标准曲线

如图2,总酚含量以没食子酸等价表示,1 mL板栗糯米清酒和糯米清酒分别约含有187.1、113.2 μg酚类物质。对比Minussi等[23]测得红葡萄酒中的酚类物质含量为1000～4000 μg/mL,板栗糯米清酒总酚含量较低,这可能主要是由于原料之间酚类含量的差异造成的。通过与糯米清酒的总酚含量对比,添加板栗可以明显提高清酒总酚含量,这与板栗中的鞣花酸等酚类物质密切相关。当然对于酒液而言,除多酚物质外,酒中自由氨基酸、美拉德反应产物等[24]对酒的抗氧化活性也可能会有一定的影响,这有待于进一步研究。

图2 两种清酒的总酚含量

2.2.2 亚油酸体系抗氧化性 采用亚油酸体系检测样品的抗氧化能力。通过反应液吸光度的变化,反映样品抗氧化能力强弱,吸光度越低,样品抗氧化能力越强。结果如图3。

图3 样品对亚油酸体系抗氧化能力

从图3可以看出,样品对亚油酸自氧化抑制能力强弱直观表现为100 μL BHA>100 μL BHT>100 μL板栗糯米清酒>100 μL生育酚>100 μL糯米清酒。所测样品吸光度均小于空白组,说明5中样品均可以有效抑制亚油酸自氧化。200 μL板栗糯米清酒>100 μL板栗糯米清酒>50 μL板栗糯米清酒,说明随着用量增加,板栗糯米清酒对亚油酸的抗氧化能力也逐渐变强,但其抗氧化能力增幅变小。图3中100 μL板栗糯米清酒抗氧化性明显高于同量的糯米清酒,说明板栗加入到糯米清酒中,可以提高酒液的抗氧化能力。96 h之后,除生育酚和空白外,其它吸光度不再增加。120 h后,所有反应基本达到动态平衡,吸光度基本趋于稳定。

随着时间增加,吸光度趋于稳定时,反应基本达到动态平衡,因此计算120 h处对亚油酸自氧化抑制率,可以准确反映待测样品对亚油酸自氧化抑制率的大小。图4为120 h相同用量的5种样品对亚油酸自氧化的抑制率,其中BHA、BHT的抗氧化能力较强,自氧化抑制率分别达到96.78%和94.18%。板栗糯米清酒的抑制率为80.70%。生育酚的抑制率较弱为70.05%,糯米清酒对亚油酸自氧化抑制率最低,仅为69.73%。

图4 100 μL样品对亚油酸自氧化的抑制率

2.2.3 还原力 采用普鲁士蓝法检测样品的还原力。通过反应液吸光度的变化,比较样品还原能力强弱,吸光度越大,样品还原力越强,结果如图5。

图5 样品的还原能力

由图5可知,随着试验样品用量增加,抗坏血酸、BHT、板栗糯米清酒、糯米清酒的还原力均呈一定用量的依赖性。用量在50～200 μL时,抗坏血酸对Fe3+的还原力远强于其它3种样品,其他样品的还原力强弱表现为BHT>板栗糯米清酒>糯米清酒。板栗糯米清酒的还原能力虽远不及其他两种抗氧化剂标品,但却高于糯米清酒,说明在清酒中添加板栗可以提高酒样的还原力。当用量超过100 μL时,抗坏血酸还原力呈现突增趋势。其他3种样品的还原力增幅相对减缓,其中板栗糯米清酒的增幅最为明显减缓。

2.2.4 金属螯合能力 采用菲啰嗪法测定样品的金属螯合能力。通过反应液吸光度的变化,比较样品金属螯合活性,吸光度越低,样品金属螯合能力越强。结果如图6。

图6 样品的金属螯合能力

由图6可知,4种样品均具有一定的金属螯合作用。用量达到200 μL后,EDTA的金属螯合率基本不再变化。而柠檬酸、板栗糯米清酒、糯米清酒在200～1000 μL之间时,其金属螯合能力均随用量增加而增加。800 μL后,柠檬酸、板栗糯米清酒、糯米清酒的增幅减缓。用量为1000 μL时,EDTA、柠檬酸、板栗糯米清酒以及糯米清酒的金属螯合率分别为92.42%、19.54%、11.57%、6.57%。因此,添加板栗提高了糯米清酒的金属螯合能力。就抗氧化剂而言,主要是通过直接方式和间接方式来实现抗氧化作用[23],直接方式主要为酚类物质直接淬灭自由基;间接方式主要是通过螯合金属离子或清除氧气等来实现。图6中1000 μL的EDTA的金属螯合活性最高在90%以上,但是1000 μL的板栗糯米清酒却仅为11%左右。由此猜想板栗糯米清酒主要不是通过金属螯合性体现抗氧化活性的,可能是通过酚类物质淬灭自由基体现的。

2.2.5 DPPH自由基清除率 DPPH是一种稳定的紫色的自由基,抗氧化物质可以与其自由基单电子配对,使其醇溶液发生颜色变化。通过溶液吸光度变化反映自由基清除能力,吸光度越小,清除DPPH自由基能力越强。

由图7中可知,4种样品均具有清除DPPH自由基的能力,其中最强的为抗坏血酸,其次为BHT,板栗糯米清酒较低,糯米清酒最弱。用量达到50 μL时,抗坏血酸对DPPH自由基清除率趋于稳定,基本不再变化。用量达到100 μL后,糯米清酒、板栗糯米清酒以及BHT对DPPH自由基清除率都出现增长减缓的趋势。用量达到200 μL时,4种样品清除率分别为81.69%、78.74%、38.67%、23.36%。

图7 样品对DPPH自由基清除能力

3 结论

通过对板栗糯米清酒的氨基酸组分分析,发现板栗糯米清酒中17种氨基酸含量均高于糯米清酒中的氨基酸含量,其中天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量是糯米清酒中的二倍以上。抗氧化活性研究表明:板栗糯米清酒具有抑制亚油酸自氧化的能力,抑制率可达到80.70%,还原能力较强,金属螯合活性较低为11.57%,DPPH自由基清除率达到38.67%,总酚含量约为187.1 μg/mL,板栗糯米清酒具有较强的抗氧化性,优于相同工艺的糯米清酒。板栗糯米清酒作为一种新型酿造酒,具有良好的养生保健功能,可以满足人们对于功能性饮品的需求,具有进一步研究和开发实际的应用价值。