分光光度法测定花生壳中总黄酮含量的研究

赵 星,李云建,韩 伟,张梦瑶,刘斯婕,李玉荣

(1.石家庄学院化工学院,河北石家庄 050035; 2.河北省农林科学院粮油作物研究所,河北石家庄 050035)

花生,又名落花生,是我国主要的油料作物,2016年我国花生年产量已达1728.98万吨,居世界首位[1]。目前,我国花生的开发利用仍以花生仁榨油为主,约占花生果重量三分之一的花生壳,仅有少量被加工成饲料和制成化工原料,利用率低,造成极大的资源浪费。花生壳中除含有粗纤维、粗蛋白、粗脂肪、糖类以及矿物质等成分外,还含有多种黄酮类成分,如木犀草素、香叶木素、5,7,3′,4′-tetrahydroxy-8-prenyflavone、圣草酚、5-羟基-色原酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、5,7,3′-trihydroxy-4′-methoxy-8-prenylflavone、大风子素、racemoflavone、5,7-二羟基色原酮等,以木犀草素含量最高[2-4]。研究表明,从花生壳中提取黄酮类化合物并生产的“脉舒胶囊”,具有良好的降血压、降血脂作用[1,5],而花生的品种、产地等因素均会影响花生壳中总黄酮的含量[6-7],因此,建立并优化出适当的检测方法对花生壳中总黄酮的开发利用与质量控制尤为重要。

总黄酮的含量测定一般采用分光光度法,包括直接测定法和可见区络合法,直接测定法由于被测溶液的基底易产生干扰,所以可见区络合法应用较多,如盐酸-镁粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法等[8-9]。目前,花生壳中总黄酮的测定多采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法[10],然而,测定过程中尚存在样品与对照溶液络合后的光谱图差别较大等问题[11],由于中药成分复杂,测定总部位时干扰成分多,为了保证测定的专属性、灵敏度与准确度,以对照品与供试品共有吸收波长为检测波长进行含量测定为佳,选择适宜的对照品与适宜的络合方法显得尤为重要。然而,不同络合方法测定花生壳中总黄酮含量的适应性研究却未有相关报道。因此,本实验选用芦丁和木犀草素两种常见对照品为参考,从方法适应性、方法重复性、供试品溶液稳定性方面比较测定总黄酮含量的三种常用络合方法,选出测定花生壳中总黄酮含量的最佳方法并进行方法学验证,为花生壳的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花生 购自河北省沧州市;木犀草素(纯度≥98%) 上海金穗生物科技有限公司;芦丁(纯度≥98%) 合肥博美生物科技有限责任公司;无水乙醇 分析纯,天津市百世化工有限公司;亚硝酸钠 分析纯,天津市河东区红岩试剂厂;硝酸铝 分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;氢氧化钠 分析纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司;无水氯化铝 分析纯,天津市永大化学试剂有限公司;无水乙酸钠、冰乙酸 分析纯,天津市欧博凯化工有限公司;浓盐酸 分析纯,武汉市鑫华松化工有限公司;镁粉 分析纯,北京求贤化工厂;蒸馏水 实验室自制。

WH-71型电热恒温干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;BJ-800A中药粉碎机 德清拜杰电器有限公司;FA2004B型电子天平 上海天美天平仪器有限公司;SB-5200DTD型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;LDZ4-12型低速自动平衡离心机 北京京立离心机有限公司;TGL-16G型高速离心机 上海安亭科学仪器厂;TU-1950双光束可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;NewClassic MF分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;HH-1数显恒温水浴锅 金坛市顺华仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的制备 分别取芦丁、木犀草素对照品适量,精密称定,置于25 mL量瓶中,以75%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得浓度分别为339、299 μg/mL的储备液,于4 ℃冷藏保存,备用,临用前以75%乙醇稀释至所需浓度。

1.2.2 样品溶液的制备 将花生壳洗净,干燥,粉碎,过60目筛,干燥至恒重。取花生壳粉末适量,精密称定,置于50 mL EP管中,精密加入75%(v/v)乙醇30 mL,润湿,室温下浸泡2 h,超声波辅助提取(50 Hz,200 W)30 min后,离心(4000 r/min)10 min,分离上清液再次离心(12000 r/min)20 min,取上清液,即得样品溶液。

1.2.3 盐酸-镁粉法 取花生壳粉末1 g,精密称定,其余按照1.2.2制备样品溶液。参考文献[12]方法,精密量取此样品溶液、113 μg/mL芦丁对照品溶液、299 μg/mL木犀草素对照品溶液各500 μL,分别置于有300 mg镁粉的具塞刻度试管中,将试管置于冷水浴(15 ℃)中,缓缓滴加3 mL浓盐酸,并不时振摇试管。待反应充分后加入75%乙醇至7 mL,置于沸水浴中加热60 min,取出,迅速冷却至室温,用75%乙醇补足至7 mL,摇匀,于350～700 nm下进行全波长扫描。精密量取75%乙醇500 μL,按上述过程操作,作为空白对照,即得样品溶液、芦丁对照品溶液、木犀草素对照品溶液盐酸-镁粉法全波长扫描图。以水代替浓盐酸,同法操作,即得未经络合样品溶液全波长扫描图。

1.2.4 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法 取花生壳粉末1.5 g,精密称定,其余按照“1.2.2 样品溶液的制备”项下操作制备样品溶液。参考文献[13-14]方法,精密量取此样品溶液、339 μg/mL芦丁对照品溶液、299 μg/mL木犀草素对照品溶液各500 μL,分别置于5 mL棕色量瓶中,加入5% NaNO2溶液150 μL,摇匀,静置6 min后,加入10% Al(NO3)3溶液150 μL,摇匀,静置6 min后,加入4% NaOH溶液2 mL,用水稀释至刻度,摇匀,转移至离心管中,室温离心(12000 r/min)3 min后,分离上清液,于350～700 nm下进行全波长扫描。精密量取75%乙醇500 μL,按上述过程操作,作为空白对照,即得样品溶液、芦丁对照品溶液、木犀草素对照品溶液NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法全波长扫描图。以水代替Al(NO3)3溶液,同法操作,即得未经络合样品溶液全波长扫描图。

1.2.5 AlCl3法 取花生壳粉末1 g,精密称定,其余按照“1.2.2 样品溶液的制备”项下操作制备样品溶液。参考文献[8]方法,精密量取此样品溶液、170 μg/mL芦丁对照品溶液、74.8 μg/mL木犀草素对照品溶液各500 μL,分别置于5 mL棕色量瓶中,加入0.1 mol/L AlCl3溶液250 μL,醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH5.5)500 μL,用75%乙醇稀释至刻度,摇匀,静置15 min,于350～700 nm下进行全波长扫描。精密量取75%乙醇500 μL,同法操作,作为空白对照,即得样品溶液、芦丁对照品溶液、木犀草素对照品溶液AlCl3法全波长扫描图。以水代替AlCl3溶液,按上述过程操作,即得未经络合样品溶液全波长扫描图。

1.2.6 方法学验证 按照《中国药典》2015版《药品质量标准分析方法验证指导原则》的相关要求进行操作[15]。

2 结果与分析

2.1 盐酸-镁粉法适应性考察

采用盐酸-镁粉法获得的芦丁对照品溶液、木犀草素对照品溶液、样品溶液、未经络合样品溶液全波长扫描图,如图1所示。由图1可知,采用盐酸-镁粉法制备的供试品溶液的全波长扫描图在370～550 nm之间存在两个吸收峰,其中最大吸收波长为423 nm,而未经络合样品溶液的全波长扫描图在此区间未出现吸收峰,二者的区别说明花生壳提取物中黄酮类成分在该试验条件下已发生络合反应。芦丁对照品的最大吸收波长为390 nm,与供试品的匹配性差。木犀草素对照品在400～550 nm之间存在两个吸收峰,且最大吸收波长为422 nm,与供试品相匹配,其图谱在350～395 nm之间吸光度出现负值,推测是由于溶液中较大浓度的木犀草素(299 μg/mL)消耗了反应体系中大量的镁离子,而镁离子在此波段具有吸收而形成。由此可见,盐酸-镁粉法可用于测定花生壳中总黄酮的含量,应选择木犀草素为对照品,测定波长423 nm,此时,样品中其他成分对测定的干扰小。

图1 盐酸-镁粉法全波长扫描图Fig.1 Full wavelength scanning of Mg-HCl method

2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法适应性考察

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法获得的芦丁对照品溶液、木犀草素对照品溶液、样品溶液、未经络合样品溶液全波长扫描图如图2所示。由图2可知,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法制备的供试品溶液全波长扫描图在400～650 nm之间存在吸收峰,且其在440～520 nm范围内吸光度曲线平缓,吸收峰不明显,而未经络合样品溶液的全波长扫描图在400～650 nm之间呈现下降趋势,二者的差异说明花生壳提取物中黄酮类成分在该试验条件下已发生络合反应,且在吸收峰处,络合前后吸光度差值小(ΔA<0.270)。为了尽可能排除样品中非黄酮类成分对测定结果的干扰,使方法具有更好的专属性,应选择供试品与未经络合样品溶液吸光度差值最大处作为测定波长,即519 nm(ΔAmax=0.269)。芦丁与木犀草素对照品在450～650 nm之间存在吸收峰,其最大吸收波长分别为514与510 nm。由此可见,NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法可用于测定花生壳中总黄酮的含量,测定波长519 nm时,样品中其他成分对测定干扰较小,木犀草素与芦丁均可作为对照品,且木犀草素较芦丁更适合。

图2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法全波长扫描图Fig.2 Full wavelength scanning of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH method

2.3 AlCl3法适应性考察

采用AlCl3法获得的芦丁对照品溶液、木犀草素对照品溶液、样品溶液、未经络合样品溶液全波长扫描图如图3所示。由图3可知,采用AlCl3法制备的供试品溶液全波长扫描图在380～500 nm之间存在吸收峰,其最大吸收波长为402 nm,未经络合样品溶液的全波长扫描图在350～500 nm之间吸光度明显下降,二者的差异说明花生壳提取物中黄酮类成分在该试验条件下已发生络合反应。芦丁对照品的最大吸收波长为417 nm,木犀草素对照品的最大吸收波长为408 nm,故AlCl3法可用于测定花生壳中总黄酮的含量,应选择木犀草素为对照品,测定波长402 nm,此时,样品中其他成分对测定干扰较小。

图3 AlCl3法全波长扫描图Fig.3 Full wavelength scanning of AlCl3 method

2.4 三种络合方法重复性的比较

取同一花生壳粉末,分别采用盐酸-镁粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法项下操作,测定波长分别为423、519、402 nm,平行6份,计算吸光度的相对标准偏差(RSD,%)。由同一分析人员使用同一台分光光度计进行方法的重复性比较,结果如表1所示。

表1 三种络合方法的重复性试验结果Table 1 Investigation on repeatability of three complexing methods

经比较后发现,采用三种方法测定花生壳提取物中总黄酮的含量,方法重复性以AlCl3法最佳(RSD<1%),其余依次为NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、盐酸-镁粉法。研究发现,盐酸-镁粉法操作过程较繁琐,极易引入偶然误差,因此方法重复性最差,且耗时长,反应过程需浓盐酸,亦存在一定危险性;NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法操作相对简便,方法重复性较盐酸-镁粉法好,但反应后的供试品溶液易产生浑浊,需经微孔滤膜过滤或高速离心后才能准确测定,操作较繁琐;AlCl3法操作简便,且方法重复性好,能够满足分析方法的测定要求[12]。由此可见,AlCl3法在测定花生壳中总黄酮含量时的方法重复性明显优于盐酸-镁粉法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法。

2.5 三种络合方法稳定性的比较

将采用盐酸-镁粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法项下制备的供试品溶液,于室温下放置0、5、10、20、40、60 min后测定吸光度,测定波长分别为423、519、402 nm,以时间为横坐标,吸光度为纵坐标作图,结果如图4所示。

图4 三种络合方法的稳定性试验结果Fig.4 Investigation on stability of three complexing methods

由图4可知,采用盐酸-镁粉法制备的供试品溶液在室温放置20 min内吸光度波动较大(RSD=7.85%),20 min后,吸光度虽略有降低,但曲线平稳,可有效减少乃至消除因供试品放置时间或测定顺序的不同而产生的测定误差(RSD=0.49%),故建议在采用盐酸-镁粉法测定花生壳中总黄酮含量时,供试品溶液于室温下静置20 min后测定。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法制备的供试品溶液的吸光度在0～60 min内呈现逐渐下降的趋势,稳定性差(RSD=9.69%),因此测定过程中,需严格控制供试品溶液的放置时间,才能有效减少乃至消除由此产生的系统误差。采用AlCl3法制备的供试品溶液的吸光度在0～60 min内几乎无变化(RSD=0.43%),稳定性好。由此可见,AlCl3法在测定花生壳中总黄酮含量时供试品溶液的稳定性明显优于盐酸-镁粉法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法,不易因放置时间或测定顺序的不同而引入误差,有利于大批量样品的同时测定。

2.6 三种络合方法的评价

芦丁是自然界中广泛存在的黄酮类成分,NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法即源自于芦丁的含量测定,后来被逐步应用于黄酮类化合物的测定[8],因此,可采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法,将总黄酮的含量以芦丁为对照品计,测定与比较不同中药总黄酮的含量。木犀草素为花生壳中含量丰富的黄酮类活性成分[3,16],研究发现,无论采用何种络合方法,同芦丁相比,木犀草素络合后的吸收峰均与花生壳中总黄酮更为接近,因此,采用络合方法测定花生壳中总黄酮的含量,可首选木犀草素作为对照品。

盐酸-镁粉法在15 ℃水浴中,利用黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇在盐酸-镁粉作用下被还原,生成橙红到红紫色物质。整个过程需控制浓盐酸的加入速度并不时振摇刻度试管,以控制盐酸和镁粉反应的剧烈程度与显色剂和样品的接触程度[17],过程较为严苛,且因使用浓盐酸而具备一定的危险性,不适用于大批量样品的同时测定,且本研究发现,在三种络合方法的比较中,该方法测定花生壳中总黄酮含量的重复性相对较差,不宜作为首选方法。

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法和AlCl3法的原理均是利用黄酮类化合物与Al3+形成的络合物。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法并非黄酮类化合物的专属反应,凡具有邻苯二羟基的物质,均能用此法进行络合显色[18]。AlCl3法则是在酸性条件下,Al3+只与酮羰基及其临位的羟基发生络合,生成黄色络合物,其反应过程如图5所示[8],可有效减少乃至消除具有邻二酚羟基结构的非黄酮类化合物的干扰,专属性更强。同时,本研究发现,在所选条件下,测定花生壳提取液中总黄酮的含量,料液比1∶15 g/mL制备的花生壳样品溶液经NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法显色后,吸光度在0.4左右,而料液比1∶30 g/mL制备的花生壳样品溶液与74.8 μg/mL木犀草素对照品溶液经AlCl3法显色后,吸光度已达0.5左右,由此可见,AlCl3法的灵敏度更高,在朗伯-比尔定律的最佳区域内易获得更宽的线性范围;另一方面,NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法供试品溶液的稳定性差,在测定过程中,需严格控制放置时间,才能有效减少乃至消除由此产生的系统误差,不适用于大批量样品的同时测定。

综合比较三种络合方法后发现,以木犀草素为对照品,测定波长为402 nm时,AlCl3法的灵敏度高、专属性好、重现性好、稳定性高,且操作简便快速,成本低廉,适用于大批量样品的同时测定,可作为花生壳中总黄酮含量测定的首选方法。

2.7 AlCl3法的方法学验证

2.7.1 标准曲线与线性范围 精密量取浓度分别为19.9、39.9、59.8、79.7、100.0 μg/mL的木犀草素对照品溶液500 μL,按照“1.2.5 AlCl3法”项下操作,于402 nm下测定吸光度。以木犀草素对照品浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,如图6所示,线性方程为y=0.0078x-0.0099(r=0.9997),表明该方法在木犀草素浓度为19.9～100 μg/mL浓度范围内,与吸光度成良好线性关系。

图6 木犀草素标准曲线Fig.6 Luteolin standard curve

2.7.2 精密度试验 取同一供试品溶液,于402 nm下测定吸光度,连续6次,计算吸光度的RSD=0.16%,表明仪器精密度良好。

2.7.3 重复性试验 取同一样品溶液,按照“1.2.5 AlCl3法”项下操作,于402 nm下测定吸光度,平行6次,计算吸光度的RSD=0.96%,表明该方法重复性良好。

2.7.4 加样回收率试验 精密量取重复性试验项下所用的样品溶液250 μL,精密加入浓度为99.7 μg/mL的木犀草素对照品溶液170 μL和75%乙醇80 μL,其余按照“1.2.5 AlCl3法”项下操作,于402 nm下测定吸光度,平行6次,结果如表2所示。回收率在97%～103%范围内,RSD=2.36%,表明该方法准确度良好。

表2 AlCl3法回收率试验结果Table 2 Investigation on recovery of AlCl3 method

2.7.5 稳定性试验 取同一供试品溶液,室温放置0、5、10、20、40、60 min后,于402 nm下测定吸光度,结果如表3所示,供试品溶液在0～60 min内稳定性良好(RSD=0.43%)。

表3 AlCl3法稳定性试验结果Table 3 Investigation on stability of AlCl3 method

3 结论

采用光谱分析技术,比较了盐酸-镁粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法对花生壳中总黄酮含量的测定效果,发现同芦丁相比,更宜采用木犀草素为对照品。盐酸-镁粉法测定花生壳中总黄酮含量时,操作繁琐苛刻,耗时长,重复性差;NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法供试品溶液稳定性差,且其他成分易干扰测定结果,灵敏度也较低。因此,测定花生壳中总黄酮含量的首选方法为AlCl3法,经方法学验证,测定波长402 nm时,木犀草素在19.9～100 μg/mL浓度范围内与吸光度成良好的线性关系,该方法专属性好,灵敏度高,准确度高,重复性好,稳定性高,且操作简便快速,成本低,适用于大批量花生壳样品中总黄酮含量的测定。本文可为花生壳中黄酮类成分的深入研究及其在功能食品和药品方面的质量控制提供参考。