茶叶中甲萘威农残表面增强拉曼光谱 (SERS)结合快速前处理检测方法的建立

朱晓宇,艾施荣,彭雄鑫,李 红,杨普香,李文金,陈 涛,吴瑞梅,*

(1.江西农业大学南昌市农产品加工与质量控制重点实验室,江西南昌 330045; 2.江西农业大学工学院,江西南昌 330045; 3.江西农业大学理学院,江西南昌 330045; 4.江西省蚕桑茶叶研究所,江西南昌 330043)

茶叶是中国的主要经济作物,而在茶叶种植过程中,存在农药不合理使用及滥用等行为,导致茶叶中常被检出农残超标问题。甲萘威(又名西维因),是一种常用于稻、茶、桑等作物的氨基甲酸酯类农药,因具有高效、低毒等特点,而被广泛使用于农产品中病虫害防治。但其具有触杀、胃毒作用,会损害人体免疫系统和神经中枢系统,人长期食用甲萘威超标农产品,易导致致癌等症状。因此,我国制定了严格的甲萘威农残限量标准。近年来,甲萘威农药残留检测方法有高效液相色谱法[1-2]、生物传感器法[3-4]、酶抑制法[5]、酶联免疫法[6]等。这些方法用于检测农药的残留,但存在前处理复杂、仪器昂贵、耗时长等缺点。

表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS)技术利用金、银等金属粗糙表面产生电磁场作用,可将吸附在金属粗糙表面的待测物拉曼信号增强106～109倍,从而提高检测灵敏度[7-8]。SERS技术具有样品制备简单、检测速度快、检测灵敏度高等优点,广泛用于食品农产品痕量农药残留[9-10]、兽药残留[11]等危害物质的快速检测。胡琪等[12]采用SERS技术对水溶液中甲萘威残留进行分析,其检测结果可达0.1 mg/L,满足国家标准。Liu等[13]利用SERS对水果中甲萘威、亚胺硫磷、谷硫磷进行检测,其检测浓度均低于6.66 ppm。农产品基质复杂,对SERS方法的检测精度影响很大。陈漾等[14]应用SERS技术检测椰汁中西维因农药残留,通过对西维因进行偶合反应,最低检出浓度达到1.7 mg/L,间接建立椰汁中西维因的分析方法,但上述方法需重氮偶合反应前处理,操作过程复杂、耗时长、成本高。

茶叶是一种常见的保健饮品,其成分复杂,对农药分子检测基质效应大,因此,有效的样品前处理是分析方法的关键。本文研究不同净化剂去除茶叶基质效应的影响,寻找一种快速、简单、高效的茶叶农药残留SERS检测的快速前处理方法,以提高方法检测精度,降低方法的检测限,建立茶叶中甲萘威农药残留的SERS快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲萘威标准品(99.0%) 美国Sigma公司;氯金酸AuCl3·HCl·4H2O(99.7%) 上海国药集团化学试剂有限公司;乙腈、无水硫酸镁、氯化钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司,有机滤膜0.22 μm 美国Agilent公司;柠檬酸三钠 分析纯,西陇化工股份有限公司;N-丙基乙二胺(PSA) 天津博纳艾杰尔科技有限公司;纳米竹炭(NBC) 上海海诺炭业有限公司;阴性茶叶样本(农药残留均在国家标准以内) 由江西出入境检验检疫局提供。

RamTracer-200-HS高灵敏度激光拉曼光谱仪 Opto Trace Technologies,Inc.;JW-1024离心机 安徽嘉文仪器装备有限公司;ZNCL-T智能恒温磁力搅拌器 郑州市亚荣仪器有限公司;VORTEX-5涡旋混合器 海门市其林贝尔仪器有限公司;FA2004电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;Hitachi S-4800扫描电子显微镜 日本Hitachi公司;T6紫外可见分光光度计 北京浦西通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金纳米增强基底的制备及表征 采用经典柠檬酸钠还原HAuCl4方法,制备金纳米增强基底[15]。具体制备过程如下:将100 mL浓度为1 mmol/L的氯金酸溶液移入到100 mL圆底烧瓶中,加热至沸腾;将3.7 mL质量浓度为1%的柠檬酸钠溶液,迅速加入到沸腾的氯金酸溶液中,继续加热并剧烈搅拌20 min,得到红棕色悬浮液,自然冷却到室温,置于-4 ℃环境下保存,备用。

取一定量的金纳米溶胶,用超纯水将其稀释后,用紫外分光光计测定稀释液的吸光度,单次扫描,扫描波长范围400～900 nm,间隔2 nm。取一定量的金纳米溶胶进行离心清洗,去除上清液,离心步骤重复2次,将浓缩的纳米金颗粒滴加于干净的硅片上,干燥后于扫描电子显微镜下观察。SEM工作电压为10 kV,电流为10 μA,工作距离为6.7 mm,放大倍数为100 k。

1.2.2 以茶叶提取液为基质甲萘威溶液的配制 称取甲萘威固体标准品1.05 g,转移至100 mL容量瓶中,用少量乙腈超声溶解后,定容至100 mL刻度线,得到105 mg/L的甲萘威标准储备液,用乙腈将标准储备液稀释成浓度梯度:100、90、65、55、40、25、20、15、10、5 mg/L。

称取2.00 g绿茶阴性样本于50 mL的离心管中,加入10 mL乙腈,涡旋2 min,4500 r/min离心5 min。取0.3 mL的甲萘威标准品和2.7 mL茶叶上清液混合,按照1∶9(甲萘威农药标准品∶茶叶上清液)用茶叶上清液将甲萘威标准溶液稀释成不同浓度梯度的含农药残留茶叶溶液:5.56、5.00、3.61、3.06、2.22、1.39、1.11、0.83、0.56、0.28 mg/kg。

1.2.3 拉曼光谱采集 分别取500 μL金胶、40 μL待测溶液、100 μL 1%氯化钠溶液加入到石英进样瓶中,混合均匀,采集拉曼信号。激发波长:785 nm,激光功率:400 mW,积分时间:10 s,积分次数:2次,分辨率:4 cm-1。每个样本采集3次,求平均值。

1.2.4 甲萘威拉曼光谱理论计算 采用GaussView 4.1 软件模拟构建甲萘威分子结构,并用Gaussian 03W优化计算拉曼谱峰,计算方法为B3LYP,计算基组6-31G,由GaussView 4.1分析计算结果,得到甲萘威理论计算拉曼谱图。

1.2.5 茶叶提取液基质优化 茶叶中样品前处理是影响分析农残检测的关键,通过对比PSA和NBC填料及用量对茶叶基质的净化效果,优选出最佳填料及用量,以提高方法的检测精度和灵敏度。

1.2.5.1 PSA填料用量优化 分别称取0、50、100、150、200、250 mg PSA填料于6个10 mL离心管中,分别加入200 mg无水硫酸镁;取2 mL含甲萘威农药残留的茶叶提取液,分别加入上述离心管中,涡旋2 min后,于转速4500 r/min离心5 min,取上清液,过0.22 μm有机滤膜,上机检测,分析PSA的净化效果及其最优用量。

1.2.5.2 NBC填料用量优化 分别称取0、15、20、25、30、35、40 mg NBC于7个10 mL离心管中,分别加入200 mg无水硫酸镁;取2 mL含甲萘威农药残留的茶叶提取液,分别加入上述离心管中,涡旋2 min后,于转速4500 r/min离心5 min,取上清液,过0.22 μm有机滤膜,上机检测,分析NBC的净化效果及其最优用量。

1.2.6 标准曲线的绘制 按照1.2.5的前处理方法,1.2.3的操作步骤采集以茶叶提取液为基质配制不同浓度甲萘威溶液(1.2.2)信号,以拉曼特征峰强度为纵坐标(Y),甲萘威浓度为横坐标(X),绘制标准曲线。

1.2.7 回收率实验测定 按1.2.2中配方法得到2.5、4.17、5.28 mg/kg 3个浓度的待测溶液,每个浓度配制3个平行样本,按照1.2.3实验条件测定拉曼特征峰强度,计算回收率和相对标准偏差(RSD)。

1.3 数据处理

使用OriginPro-2016 9.0和MATLAB R2014a对实验数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 金纳米溶胶表征

图1是金溶胶紫外吸收光谱图(a)和电镜扫面图(b)。从图1可看出,金溶胶最大吸收峰为540 nm,该吸收峰呈单峰,表明试验所制备的金纳米粒子呈球形,且粒径均匀,粒径约为55 nm[16]。采用电镜扫描图可进一步对金纳米粒子进行表征,由图(b)可以看出,金纳米粒子呈球形,粒径约为55 nm,分散效果良好。

图1 金纳米溶胶的UV-Vis图(a)和SEM图(b)Fig.1 UV-Vis spectrum(a) and SEM(b)spectrum of gold colloids

2.2 甲萘威标准溶液的普通拉曼光谱与SERS光谱分析

图2(a)、(b)、(c)和(d)分别是浓度为2 mg/L甲萘威标准溶液的SERS、普通拉曼光谱、乙腈的SERS和金纳米胶体拉曼谱图。从图2(d)中可看出,金溶胶中未出现拉曼峰,说明增强基底不会对试验产生干扰。由图2(b)和(c)可看出,甲萘威普通拉曼光谱与乙腈SERS谱图基本相似,说明甲萘威普通拉曼谱图中农药分子特征峰未得到增强;而图2(a)具有明显的拉曼谱峰,说明所制备的金纳米胶体对甲萘威分子增强效应显著。

图2 2 mg/L甲萘威标准溶液的SERS(a)和普通拉曼光谱(b)、乙腈的SERS(c)、金纳米胶体的光谱(d)Fig.2 SERS(a)and ordinary Raman spectroscopy(b)of 2 mg/L carbaryl standard solution,SERS of acetonitrile(c) and Raman spectrum of gold nanocolloid(d)

2.3 茶叶中甲萘威分子特征谱峰的确定

2.3.1 甲萘威分子的理论计算谱峰与试验谱峰分析 图3(a)是浓度为10 mg/L甲萘威标准溶液的SERS,(b)是甲萘威分子的理论计算拉曼光谱。从图3可看出,在1211 cm-1处,试验谱峰与理论计算谱峰完全一致,而923、1106、1487、1528、1557 cm-1处试验谱峰与理论计算谱峰略有偏移。在768、1039、1349、1409 cm-1处存在理论计算谱峰,而试验谱峰中未出现,在806、1003、1057、1426 cm-1处,试验谱峰出现而理论谱峰未出现。这是因为,甲萘威分子与溶剂分子之间存在相互作用力,导致增强基底对不同官能团产生的增强效果差异较大,从而使试验拉曼谱峰出现偏移现象,而理论模拟谱峰是在理想状态下对单个分子进行模拟仿真计算,未考虑分子间作用力影响,从而出现有些试验谱峰与理论计算谱峰略有偏移,有些谱峰在理论计算和试验中不会同时出现[17]。

图3 浓度为10 mg/L甲萘威标准溶液的SERS(a)和甲萘威的理论计算谱峰(b)Fig.3 SERS for 10 mg/L carbaryl standard solution(a) and the theoretical Raman spectrum of carbarly(b)

表1 甲萘威的拉曼谱峰归属Table 1 Assignment of Raman peaks of carbaryl

甲萘威分子结构中含有萘环、-C-O-、-C-H-、-C-N-、-C=C-、-N-H-等官能团,不同官能团对应的拉曼振动谱峰不同,对甲萘威分子进行谱峰归属[13]。表1是甲萘威理论拉曼谱峰与试验谱峰归属结果,其中1557、923、1106、1211、1487、1528 cm-1的理论计算谱峰和试验谱峰基本相吻合,对这些谱峰进行归属,1557 cm-1处峰强最高,归属于萘环上-C=C-的伸缩振动,923 cm-1归属于萘环的变形振动,1106 cm-1归属于C10H7O-C-上-C-O-的伸缩振动,1211 cm-1主要归属于CH3-NH-上-C-N-的伸缩振动,1487 cm-1归属于氨基上-N-H-的伸缩振动,1528 cm-1归属甲基上-C-H-的摇摆振动。上述振动谱峰可作为甲萘威分子的特征峰。

2.3.2 茶叶中甲萘威农药谱峰分析 图4(a)是浓度为10 mg/L甲萘威标准溶液的SERS,(b)是阴性茶叶提取液SERS,(c)是浓度为10 mg/L含农残茶叶提取液的SERS,(d)是乙腈的SERS。从标准溶液谱图4(a)及表1可知,923、1106、1211、1487、1528、1557 cm-1是甲萘威农药分子的特征谱峰;4(b)图中阴性茶叶基质的SERS谱图中有大量谱峰,但并未出现甲萘威分子的特征谱峰;含农残茶叶提取液SERS的谱图4(c)也有大量谱峰。对比图4(b)、4(c)和4(d)及表1可知,含农残茶叶提取液SERS的谱图中出现了3个甲萘威分子特征谱峰:1103、1213、1557 cm-1,这些特征谱峰与茶叶成分的谱峰并不重叠。由此得出,1103、1213、1557 cm-1这3个特征峰可用于定性定量分析茶叶中甲萘威农药残留。

图4 10 mg/L甲萘威标准溶液SERS(a)、阴性茶叶提取液SERS(b)、浓度为10 mg/L以茶叶 提取液为基质的甲萘威SERS(c)、乙腈的SERS(d)Fig.4 SERS for 10 mg/L carbaryl standard solution(a), SERS of negative matrix of tea extraction(b)and SERS of 10 mg/L carbarly solution based on tea extraction(c),SERS of acetonitrile(d)

2.4 茶叶提取液净化优化结果分析

2.4.1 PSA优化结果分析 图5是不同PSA用量对茶叶中色素的净化效果图(A)和SERS(B)。从图5(A)中可以看出,随着PSA用量增加,茶叶上清液颜色无明显变化,说明PSA对绿茶基质中的色素吸附作用较差,不能消除基质干扰。在拉曼谱图(B)中也没有出现甲萘威的特征峰,说明茶叶中甲萘威农药分子的拉曼谱峰受到茶叶基质效应的干拢,PSA净化剂并不能消除茶叶的基质效应。

图5 不同用量PSA对茶叶提取液基质效应的净化处理效果图(a)和SERS光谱(b)Fig.5 Purification effect(a)and SERS spectra(b)of tea extraction treated by different dosage of PSA

2.4.2 NBC优化结果分析 图6是不同NBC用量对茶叶中色素净化效果图(a)和SERS(b)。由净化效果图(a)可看出,当NBC用量为15 mg时,能消除大量色素,但净化液中还能见到少量颜色;当用量为20 mg时,净化液无色透明,说明NBC净化剂能吸附茶叶中的色素,以去除茶叶中色素的荧光效应。当NBC用量为20～25 mg时,SERS图(b)未出现甲萘威的特征峰,而当NBC用量为30 mg时,出现了甲萘威的1103、1213、1557 cm-1特征峰(图中为1106、1215、1557 cm-1),说明30 mg NBC的用量能消除茶叶成分对农药分子的基质效应。当NBC用量继续增加为35、40 mg时,拉曼谱图相较于NBC为30 mg时,甲萘威特征峰无明显变化。因此,本研究采用30 mg NBC的用量用于消除茶叶的基质效应。

图6 不同用量NBC对茶叶提取液基质效应的净化处理效果图(a)及SERS光谱(b)Fig.6 Purification effect(a)and SERS spectra(b)of tea extraction treated by different dosage of NBC

2.5 茶叶中甲萘威农药残留分析

图7是含甲萘威农药残留的茶叶提取液SERS,从图7可知,当甲萘威浓度降低时,其特征峰强度也随之减弱,浓度为3.61 mg/kg时,1103、1213 cm-1处谱峰已无法识别,而1557 cm-1处谱峰信号清晰可见;浓度为0.83 mg/kg时,1557 cm-1处谱峰仍可辨出,而浓度为0.56 mg/kg时,未见该特征谱峰,说明本方法检测茶叶中甲萘威农药的最低检出浓度可达到0.83 mg/kg,符合我国规定甲萘威农药残留最大限量标准的检测限1 mg/kg,单个样本检测可在10 min内完成。

由图7可知,1557 cm-1特征峰强度最强,且峰型好,故选用1557 cm-1处的峰强度与茶叶中甲萘威浓度建立标准曲线,在浓度0.28～5.56 mg/kg范围内,建立的相关曲线为y=0.1036x+1.8642,决定系数R2=0.9744。图8是以1557 cm-1特征峰强度制作的标准曲线图,由图8可知,1557 cm-1特征峰强度与茶叶中甲萘威浓度呈现良好的线性关系。

图7 甲萘威农药残留的茶叶提取液SERS光谱Fig.7 SERS spectra of tea extracts containing carbaryl pesticide residues 注:a～j:5.56、5.00、3.61、3.06、2.22、 1.39、1.11、0.83、0.56、0.28 mg/kg。

图8 以茶叶提取液为基质的甲萘威溶液曲线Fig.8 Standard curve of carbaryl solution based on tea extraction

2.6 方法准确度与精密度分析

向阴性茶叶提取液中加入甲萘威农药标准溶液,配制2.5、4.17、5.28 mg/kg 3个浓度梯度的待测液,每个浓度测定3个平行样本,得到方法的回收率和相对标准偏差,以检验方法的准确度和精密度,结果见表2。方法平均回收率在76.5%～94.9%之间,相对标准偏差(RSD)为3.87%～6.98%,说明本方法用于分析茶叶中甲萘威农药残留是准确可靠的。

表2 茶叶中甲萘威的平均回收率和相对标准偏差Table 2 Average recovery and relative standard deviation of carbaryl in tea

3 结论

本文研究茶叶中甲萘威农药残留的表面增强拉曼光谱快速检测方法。采用金溶胶为增强基底,对比分析PSA和NBC填料及其用量对检测结果的影响,发现PSA对茶叶基质的净化效果较差,而NBC净化效果明显,并得出NBC填料的最优用量为30 mg。结合密度泛函理论,确定了定性定量分析茶叶中甲萘威农药残留的3个拉曼特征峰:1103、1213、1557 cm-1。在浓度0.28～5.56 mg/kg范围内,以1557 cm-1处峰强度建立了茶叶中甲萘威农药残留的定量分析曲线:y=0.1036x+1.8642,决定系数R2=0.9744。此方法平均回收率在76.5%～94.9%之间,相对标准偏差(RSD)为3.87%～6.98%结果表明该方法的准确度和精密度较好。该方法分析茶叶中甲萘威农药残留的最低检出浓度为0.83 mg/kg,达到我国规定甲萘威农药残留最大限量标准的检测限(1 mg/kg)。本方法前处理简单、单个样本检测在10 min内完成,而采用高效液相色谱法约需30 min,且检测成本高[18]。该研究可为茶叶中农药残留快速检测装置开发提供方法支持。