一种含肉桂醛包装纸对面包腐败发霉的抑制作用

田 芳,李凯龙,李 勇,唐娇艳,张周洋

(1.郴州市食品药品检验检测中心,湖南郴州 423000; 2.湖南省食品质量监督检验研究院,湖南长沙 410111)

面包营养丰富,水分含量高,容易发霉变质,特别是在高温高湿环境中,两三天内就能长霉,使其失去食用价值,造成浪费,且易引起食物中毒。因此抑制面包霉腐变质,延长面包货架期,是一个重要的食品安全问题。匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)亦称黑面包霉,极易侵染在密闭潮湿环境中存放的面包和水果。抑制切片面包霉变的传统方法主要有紫外线灭菌处理、无菌包装和添加化学防腐剂(如苯甲酸、丙酸钙、脱氢乙酸和山梨酸)等[1]。随着食品包装新材料和新技术的开发应用,将具有抗菌活性的天然抗菌剂添加到食品包装材料上是现代食品包装的趋势,一方面,活性包装材料可以减少微生物污染,保障食品品质;另一方面则可有效减少食品中防腐剂的添加,满足消费者的购买需求[2-5]。前人研究结果表明,天然香精油因其富含萜烯类和酚类化合物,具有很强的抗菌特性[6],可以作为食品防腐剂添加到食品中发挥其抗菌作用[7-8],也可以添加到食品包装中制成抗菌活性包装材料发挥其抗菌作用[9]。

从肉桂中提取的肉桂精油,对细菌、霉菌和酵母均有很强的抑制作用,且短暂的加热处理对肉桂精油的抑菌效果无明显影响[10]。而肉桂精油中肉桂醛的含量为86.8%,是其主要抗菌成分[11-12]。植物源肉桂醛作为一种天然香料,已被联合国粮农组织与世界卫生组织(FAO/WHO)以及美国食品药品监督管理局(FDA)认定为安全无毒的化学成分,食品添加剂联合专家委员会(JECFA)和美国香味料和萃取物质制造者协会(FEMA)也认定其为一种安全放心的食品香料成分和食品添加剂,我国也于2011年将其纳入食品添加剂国家安全标准GB28346-2012[13]。研究表明肉桂醛可能是通过损伤霉菌细胞质膜而进入细胞,改变胞内大分子空间结构导致霉菌正常的新陈代谢被破坏,从而抑制霉菌的生长[14]。王新伟等[15]的研究表明肉桂醛对面包酵母和黑曲霉均有明显的抑制作用,且肉桂醛体外抗菌活性测定气体扩散法抗黑曲霉效果优于牛津杯法。本研究通过将含量不同的肉桂醛石蜡涂层应用于包装纸上,制成一种新型面包抑菌活性包装材料,研究活性包装材料及其内面包对黑面包霉的抑制作用,同时通过设置间接扩散实验和测定活性包装材料内面包中肉桂醛的含量,用以探索肉桂醛应用于面包包装材料的可行性及其发挥抑菌作用的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

OPP透明食品自粘包装纸(食品级) 桐城市昌宏包装有限公司;特级小麦粉 郴州市步步高超市;植物源提取肉桂醛 上海阿拉丁生化科技有限公司;食品包装石蜡(食品级) 郑州松泰化工产品有限公司;黑面包霉(RhizopusstoloniferATCC30306) 中国微生物菌种保藏中心;乙酸乙酯(色谱纯) 德国Meker公司;马鞭草烯酮标准品(CAS No.:18309-32-5) 法国中草药EXTRASYNTHESE公司;平板计数琼脂(生化试剂) 青岛海博生物技术有限公司。

Hewlett-Packard 6890N气相色谱仪、5975B inert XL MSD质谱检测器 美国安捷伦科技有限公司;SPX-100B-Z恒温培养箱 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;DHG-9140A电热鼓风干燥箱 上海培因实验仪器有限公司;BCD-196TXZ型冰箱 青岛海尔股份有限公司;Milli-Q净化器 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 微生物的培养 取保存于-20 ℃冰箱中的匍枝根霉R.stoloniferATCC30306冻干菌种,在PDA培养基中于30 ℃条件下孵化5 d得到活化霉菌,利用生理盐水冲洗培养皿盖子上的真菌孢子收集得到孢子悬浮液,调整孢子悬浮液浓度为102CFU/mL备用。

1.2.2 面包制作工艺 面包制作按照国家标准(GB/T 14611)小麦粉面包烘焙品质试验直接发酵法[16],经过称样、和面、发酵和揉压、成型、醒发、烘烤制得到即食面包,然后将面包切成均匀的切片面包,现做现用。

1.2.3 活性包装纸的制作 将食品级石蜡加热到60 ℃后添加不同质量的肉桂醛,得到肉桂醛质量分数分别为1%、2%、4%和6%(w/w)的混合石蜡涂液,然后将相同质量的石蜡均匀涂布薄薄的蜡层于OPP透明食品自粘包装纸的一面,常温条件下干燥后待用。涂布不添加肉桂醛石蜡的包装纸为阴性对照,不涂布石蜡的包装纸为空白对照。

1.2.4 包装纸体外抑菌实验 体外抑菌实验:将100.0 μL 102CFU/mL的孢子悬浮液接种于土豆培养基中,每处理设置10个培养皿,随后将空白对照包装纸、阴性对照包装纸和活性包装纸剪成1 cm×1 cm的小方块粘在培养皿盖上,25 ℃培养箱中培养(时间以空白对照培养基中长出霉菌为准),评估肉桂醛不同含量活性包装纸的抑菌效果,所有处理重复10次,抑菌率以长出霉菌培养皿数占总培养皿的比例计算而得。

1.2.5 切片面包防霉实验 通过前期预实验发现1.0×105CFU/mL是诱导面包霉变的最佳孢子溶度,因此将孢子浓度为1.0×105CFU/mL或1.0×106CFU/mL的200 μL孢子悬浮液涂抹在一片切片面包上,然后将感染黑面包霉的切片面包放置于两片没有感染黑面包霉的面包中间,然后分别用空白对照、阴性对照和1%～6%肉桂醛含量的包装纸包装,置于25 ℃恒温培养箱中保存,观察记录各处理包装纸中面包开始发生霉变的天数。

在培养箱中保存第3 d,分别取每个包装纸中的两侧和夹心面包各7 g,在无菌操作台上剪碎混匀后置于均质袋中,参照GB 4789.2-2016在25 ℃恒温培养箱中培养48 h后,测定面包中黑面包霉的菌落总数,所有样品重复测试3次,抑菌率计算方法为:

抑菌率(%)=(空白对照菌落总数-处理菌落总数)/空白对照菌落总数×100

式(1)

表1 切片面包防霉应用实验Table 1 Experiment on anti-mildew of sliced bread

1.2.6 活性包装纸内切片面包中肉桂醛含量的测定 1.2.5中不同处理方式的面包在25 ℃恒温培养箱中保存3 d后,进行肉桂醛含量的检测。根据文献方法[17]和预实验结果,本研究肉桂醛含量测定方法如下:切片面包进行粉碎后,随机称取0.3 g样品置于20 mL萃取瓶中,加入3.0 mL乙酸乙酯后用力振荡3 min,静置20 min,随后乙酸乙酯提取物直接进行GC/MS分析。GC/MS分析在安捷伦公司配备有5975B inert XL MSD质谱检测器的Hewlett-Packard 6890N气相色谱质谱联用仪上执行,采用HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),升温程序:70 ℃保持1 min,以2 ℃/min升至85 ℃,随后以5 ℃/min升至170 ℃,最后以5 ℃/min升至220 ℃,保持3 min;采用不分流进样,进样注射器和进样口温度250 ℃,进样量为1.0 μL;载气(99.999%,He),流速1.0 mL/min,压力96.1 kPa。采用马鞭草烯酮作为内标进行定量分析,通过连续测定切片面包中肉桂醛的含量来评估方法的可行性,直到检测加标回收率达到98%以上,当天重复检测标准偏差不超过2.4%时才开始进行正式样品的检测。根据内标物保留时间、峰面积As,样品目标色谱峰保留时间、峰面积Ai,样品量Mi和内标量Ms,应用内标法相对定量公式计算肉桂醛含量(Mn):

式(2)

1.3 数据处理

采用Excel表格进行数据统计和作图,利用SPSS软件对数据进行统计分析,两个处理数据采用t检验进行比较,两个以上处理数据采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)进行比较,p<0.05视为不同处理具有显著性差异的判定标准。

2 结果与分析

2.1 活性包装纸的抑菌活性

本研究测定了1%～6%肉桂醛石蜡涂层的抑菌活性包装纸对培养基中黑面包霉的体外抑菌作用(n=10),与空白和阴性处理比较发现,随着肉桂醛含量的增加,抑菌活性包装纸的抑菌率也相应增加,涂层肉桂醛成分含量6%的抑菌活性包装纸的抑菌率达到了100%,4%抑菌活性包装纸的抑菌率为80%,2%抑菌活性包装纸的抑菌率为20%,1%抑菌活性包装纸的抑菌率为0(图1)。本研究通过石蜡来添加肉桂醛有利于肉桂醛的缓慢释放和增加肉桂醛的稳定性。结果表明,肉桂醛通过石蜡涂层可添加到包装纸中,且制作的活性包装纸具有很好的间接抑菌效果。有研究表明肉桂醛具有高的正辛醇/水分配系数,在普通的材料中具有溶解性、扩散性和很好的渗透性,可以通过控制其释放行为发挥抗菌作用[18-19],本研究发现的其间接抑菌效果机理还有待进一步研究。

图1 不同肉桂醛含量活性包装纸体外抑菌试验Fig.1 In vitro antibacterial test of active wrapping paper with different concentration of cinnamaldehyde

2.2 活性包装纸面包防霉应用及其内面包抑菌活性

将新鲜制作的切片面包分别用对照包装纸和1%～6%肉桂醛含量的包装纸包装,置于25 ℃恒温培养箱中观察结果,对照组包装面包在第3 d就发生霉变了,而1%、2%、4%和6%肉桂醛含量的包装纸中的面包分别在第3、第5、第15、第24 d才开始发生霉变。结果表明,肉桂醛显著抑制了面包霉变的发生,延长了面包保存时间。肉桂醛对于食品中大多数真菌具有很好的抑制作用,其可通过损伤霉菌细胞质膜而进入细胞,使霉菌胞内大分子空间结构改变,生长繁殖和产毒代谢被破坏,从而抑制霉菌的生长和霉菌毒素的产生[14,20]。

通过测定保存3 d面包中的真菌含量,研究活性纸包装面包的抑菌活性。结果表明(图2),面包中霉菌孢子接种浓度为1.0×105CFU/mL时,4%和6%肉桂醛活性包装纸对真菌具有64.0%和93.4%的抑菌率,而1%和2%肉桂醛活性包装纸对真菌只有0.5%和4.2%的抑菌率;而面包中霉菌孢子接种浓度为1.0×106CFU/mL时,4%和6%肉桂醛活性包装纸对真菌具有58.4%和83.2%的抑菌率,而1%和2%肉桂醛活性包装纸对真菌只有0.2%和2.8%的抑菌率,抗菌活性与孢子接种浓度为1.0×105CFU/mL时没有显著差异,说明肉桂醛活性面包包装纸的抑菌效果随肉桂醛浓度的增加而增加,而接种真菌孢子浓度的初始浓度与抗菌活性之间没有直接关系。通过肉桂醛对镰刀菌的抑菌作用研究也发现肉桂醛的抑菌性能存在剂量-效应关系,抑菌效果随肉桂醛浓度的增加而增加[21],而抑菌实验中肉桂醛熏蒸法比直接接触法的抑菌效率更高[15,17,22],所以本研究在面包包装纸上添加含有肉桂醛的石蜡涂层,可以更好的抑制没有和包装纸直接接触面包上的黑面包霉。

图2 不同活性包装纸包装内面包的抑菌试验Fig.2 Antibacterial test of packaged bread in different active wrapping paper

2.3 活性包装纸内面包中的肉桂醛含量及其与抑菌作用的关系

肉桂醛对真菌的抑制作用主要发生在真菌菌丝生长期,所以在真菌发生的前3 d肉桂醛的浓度对于其抑制作用具有重要影响[23-24]。因此本文通过测定保存3 d一个包装中两侧面包和夹心面包的肉桂醛含量来分析肉桂醛含量与其抑制作用的关系,结果发现面包中肉桂醛含量与活性包装纸石蜡涂层中肉桂醛的含量呈正相关(R2=0.9625和0.9679),不同活性包装纸包装的夹心和两侧面包片中肉桂醛含量均没有显著性差异(图3)。2%实验组夹心和两侧面包中肉桂醛的最终浓度为19.7和22.7 μg/g,而4%实验组夹心和两侧面包中肉桂醛的最终浓度为60.9和62.7 μg/g。结合图2分析,说明肉桂醛对黑面包霉的抑制作用与面包中肉桂醛浓度有关,且初期的抑制浓度对抑制效果具有重要作用。接种真菌孢子的面包片放置在两片没有接种真菌孢子的面包中间,所以活性包装纸与接种真菌孢子之间没有直接接触。综合活性包装纸体外抑菌结果图1、实际面包抑菌结果图2和面包中肉桂醛含量结果图3分析表明,肉桂醛可通过非接触发挥抑菌作用而非仅仅通过直接接触发挥抑菌作用,且通过直接接触扩散到面包上的肉桂醛的量很少。这一实验结果为肉桂醛通过间接扩散从包装纸中转移到包装内的面包中而发挥其抑菌活性提供了直接证据。

图3 不同活性包装纸包装内两侧和夹心面包中肉桂醛浓度测定Fig.3 Concentration of cinnamaldehyde in lateral and centralslices bread in different active wrapping paper

3 结论

肉桂醛对黑面包霉具有很好的抑制作用,由固体石蜡涂制的活性包装纸具有很好抗黑面包霉活性。石蜡涂层中肉桂醛含量越高,活性包装纸和包装内面包抗菌活性越强,石蜡涂层中肉桂醛含量达到4%是抑制黑面包霉,防治面包发霉的最小浓度,可达到延长面包货架期的目的。本实验中的活性包装纸和黑面包霉没有直接接触,但其包装内不同位置的切片面包均具有很好的抑菌作用,所以这可能是肉桂醛通过非接触方式扩散至面包中而发挥抑菌作用的,但没有更近一步的证据证明这种扩散方式。且这种非接触方式的作用机理及肉桂醛扩散过程中是否对黑面包霉具有靶向作用还有待进一步研究。