银杏落叶粗多糖除蛋白方法的筛选及优化
2019-07-10王筱瑜季子非萨日娜耿丽晶
王筱瑜,季子非,萨日娜,耿丽晶,周 围
(锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001)
银杏叶是银杏科银杏树的叶。银杏树是古老的树种之一,世界上70%的银杏资源分布在我国[1]。目前,已经从银杏叶中发现了140多种化学成分[2],这说明银杏叶存在很大的开发潜力。目前,我国每年有大量的银杏落叶被燃烧处理,不但浪费资源,而且污染环境,如若将其有效成分提取出来,运用到医药、食品等行业中,将对人类生活有较大意义。银杏多糖是银杏叶中的一种有效成分,其可从银杏叶、果和外种皮中提取,具有抗肿瘤、调节免疫、降血脂[3]、抗炎[4]、抗氧化[5]等功能。姚鑫[6]的研究表明,银杏落叶中的多糖含量高于其他时期,而影响银杏落叶中的多糖提取率的主要影响因素是提取过程中蛋白的去除效果。植物多糖最常用的清除蛋白方法是Sevage法和TCA法,虽然除蛋白效果较好[7],但多糖损失较多[8],且该两种方法所涉及的试剂氯仿、正丁醇和三氯乙酸等均为有毒的有机试剂,存在安全隐患。
为获得更高多糖提取率和更为安全的银杏落叶多糖,本实验以银杏落叶为研究对象,比较Sevage法、TCA法、等电点法和酶法的除蛋白效果和多糖损失率,并将筛选除蛋白效果最佳的酶法和等电点法相结合,运用响应面法优化出一种除蛋白效率更高、更安全的银杏落叶多糖除蛋白方法,为进一步提供可食用性多糖除蛋白的方法提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
银杏落叶 锦州医科大学2017年11月校园内收集;木瓜蛋白酶 CAS:G8430,酶活力:≥60万,纯度99%,索莱宝生物科技有限公司;纤维素酶 CAS:C109262,酶活力:1万,阿拉丁生化科技股份有限公司;葡萄糖标准品 CAS:14431-43-7,纯度99%,上海山浦化工有限公司;考马斯亮蓝试剂盒 CAS:A045-2,南京建成生物工程研究所;透析袋MD55 截留分子量3500 Da,上海哈灵生物科技有限公司;蒽酮等试剂均为分析纯 天津风船化学试剂科技有限公司。
HH-1型电子恒温水浴锅 上海医疗器械五厂;752型紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;HR/T20MM立式高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司;PHS-3C型精密pH计 上海雷磁;FD-1B-80冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;RE5298A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;JYL-C051物料机 九阳股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 银杏落叶多糖的提取 将收集来的银杏落叶清洗后在鼓风干燥箱中于60 ℃烘至完全干燥,并在物料机中研磨成粉末。准确称取5.0 g银杏落叶粉末,按料液比1∶30 g/mL加入蒸馏水,添加2%的纤维素酶,酶解pH为5.0,酶解温度为50 ℃,酶解40 min后,再于80 ℃浸提3 h,重复浸提两次。合并浸提液,浓缩至体积1/3,加入4倍体积的95%乙醇,混匀后4 ℃过夜,收集沉淀冷冻干燥后得银杏落叶粗多糖。测得粗多糖得率为61.29%±0.13%,粗多糖中的多糖含量为88.12%±0.16%。
1.2.2 评价指标
1.2.2.1 多糖含量测定 配制0.1 mg/mL的水溶性粗多糖溶液,以葡萄糖溶液做标准曲线,参考王宏军等[9]方法,测定样品的吸光度A620,以葡萄糖标准品浓度(mg/mL)为横坐标,以吸光度(A620 nm)为纵坐标,绘制标准曲线图得到葡萄糖浓度与吸光度的线性关系方程为y=16.677x+0.0423,决定系数R2=0.998,并按照公式计算多糖含量。
多糖质量(mg)=测定多糖浓度(mg/mL)×样液体积(mL)
1.2.2.2 多糖损失率的计算
式中:A0为除蛋白前样品中多糖含量,%;A1为除蛋白后样品中多糖含量,%。
1.2.2.3 蛋白含量测定 配制50 mg/mL样品溶液,根据考马斯亮蓝蛋白定量测试盒说明书的方法,以蛋白标准品为对照,双蒸水调零,于波长595 nm处测定吸光度,根据公式计算样本蛋白浓度。
待测样本蛋白浓度(mg/mL)=(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(0.5 mg/mL)
1.2.2.4 除蛋白率的计算
式中:C0为除蛋白前样品中蛋白浓度,mg/mL;C1为除蛋白后样品中蛋白浓度,mg/mL。
1.2.3 除蛋白方法的筛选
1.2.3.1 Sevage法 配制50 mg/mL水溶性粗多糖溶液,参考胡日查[10]、陈静静等[11]的Sevage除蛋白方法配制Sevage混合液(氯仿∶正丁醇=4∶1,v/v),加入样品溶液体积1/4的混合液,震荡后静置20 min,5000 r/min离心10 min,除去下层变性蛋白沉淀,重复此方法直至无沉淀物后进行测定。
1.2.3.2 TCA法 配制50 mg/mL水溶性粗多糖溶液,参考阮世良[12]的TCA方法除蛋白后,5000 r/min离心10 min,取上清进行测定。
1.2.3.3 酶法除蛋白 配制50 mg/mL水溶性粗多糖溶液,参考陈静静等[11]的木瓜蛋白酶法除蛋白,调节pH为6.0,酶解后放至室温,于5000 r/min离心10 min,取上清溶液调pH为中性(pH=7.0),灌装至透析袋透析,用流动的自来水透析12 h,蒸馏水透析24 h,每2～3 h更换一次蒸馏水[13]。透析后进行测定。
1.2.3.4 等电点法除蛋白 配制50 mg/mL水溶性粗多糖溶液,用1%的盐酸调节pH到2.5,参考陈丽娟[14]的等电点法除蛋白,4 ℃沉淀过夜后取上清液,用1%的NaOH调pH到7.0,进行测定。
1.2.4 酶-等电点法除蛋白关键因素的优化 根据1.2.3实验结果,经过综合考量,选择酶法结合等电点法进行除蛋白工艺的优化。首先,进行酶法除蛋白工艺优化,再利用响应面法进一步优化酶-等电点结合法除蛋白工艺参数。
1.2.4.1 酶法除蛋白关键单因素实验 参考陈丽娟[14]中的除蛋白方法,以除蛋白率和多糖损失率为考察指标,实验设计如下,分别取5 mL 50 mg/mL的水溶性粗多糖溶液于试管中,以木瓜蛋白酶做水解酶,分别考察酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、酶解时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3 h)、酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)、酶解pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)四个单因素,在考察某一单因素时,其他基础条件为固定酶添加量1.0%,酶解时间1 h,酶解温度45 ℃,酶解pH=5.0。在酶解结束后结合等电点法,即将样品溶液pH调节至2.5,于4 ℃放置过夜,5000 r/min离心10 min,取上清溶液调节pH为中性(pH=7.0),透析48 h后测定蛋白浓度。
1.2.4.2 响应面法优化酶-等电点法除蛋白方法 根据单因素实验结果,以除蛋白率(%)为指标,选取每个单因素中三个效果最佳的水平设计响应面试验,以确定酶法除蛋白的最佳方法,Box-Behnken试验因素与水平如表1。
表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design
1.3 数据处理
每个实验平行重复3次,数据用Mean±SD形式表示。用SPSS 17.0进行相关性、显著性分析和Design-Expert V8.0.6统计软件对数据进行处理和统计分析。统计结果中不同大写字母表示不同组间均数差异极显著(p<0.01),不同小写字母表示不同组间均数差异显著(0.01
2 结果与分析
2.1 除蛋白方法比较结果
以多糖损失率和除蛋白率为指标,比较四种清除蛋白方法。结果显示(图1),Sevage法清除蛋白的效果(除蛋白率为72.02%)最好(p<0.01),但多糖损失率(26.95%)也最高(p<0.01);酶法(除蛋白率为67.54%)的清除蛋白效果低于Sevage法,差异极显著(p<0.01),但酶法的多糖损失率(14.29%)极显著低于Sevage法和TCA法(p<0.01);TCA法(除蛋白率为59.11%)清除蛋白效果低于酶法,差异极显著(p<0.01),且多糖损失率(15.44%)也高于酶法(p<0.01);等电点法除蛋白效果(除蛋白率为49.85%)相对其他方法较差(p<0.01),但多糖损失率(9.51%)也最低(p<0.01),可降低至10%以下。实验中发现,Sevage法和TCA法中的有毒有机溶剂在醇沉过程中仍有残留,虽然除蛋白率都较高,但相对安全性过低;酶法清除蛋白效果相对较好,且方法安全,但对于多糖损失仍有提升空间,故本实验最终选择以危害较低的酶法和等电点法开展下一步实验,将酶法和等电点法结合,以提高除蛋白率,降低多糖损失率。
图1 四种除蛋白法组间比较结果Fig.1 Comparison of three protein removal methods
2.2 酶-等电点结合法除蛋白方法优化结果
2.2.1 单因素实验结果
2.2.1.1 酶添加量对除蛋白率及多糖损失率的影响 由图2可知,随着酶添加量的增加除蛋白率也上升,但添加量大于1.0%～2.0%除蛋白率开始极显著下降(p<0.01),随后保持稳定,其原因可能由于过量的蛋白酶残留[15],影响最终蛋白清除率。多糖损失率变化缓慢,无明显上升趋势,说明木瓜蛋白酶的添加量对多糖损失并无影响。综合评价选择酶添加量1.0%为宜。
图2 酶添加量对除蛋白率与多糖损失率的影响Fig.2 Effects of enzyme addition on protein removal rate and polysaccharide loss rate
2.2.1.2 酶解时间对除蛋白率及多糖损失率的影响 由图3可知,木瓜蛋白酶开始酶解后,除蛋白率逐渐上升,达到1 h后,除蛋白率趋于平稳,此结果说明酶解1 h几乎可以达到完全水解,所以除蛋白率不再升高,整个过程多糖损失率没有明显变化,这与张曜武等[16]研究的结果相似。综合评价选择酶解时间1 h为宜。
图3 酶解时间对除蛋白率与多糖损失率的影响Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis time on protein removal rate and polysaccharide loss rate
2.2.1.3 酶解温度对除蛋白率及多糖损失率的影响 由图4可知,随着酶解温度的升高除蛋白率也升高,达到45 ℃时除蛋白率开始下降,可能与酶的最适作用温度有关,温度过高会影响木瓜蛋白酶的活性,导致酶解效果降低[17]。温度升高时,酶化的反应和水解率速度都会增加,但温度过高会导致底物蛋白的变性[18]。该过程中多糖损失率也随温度的升高缓慢上升的趋势,但无显著差异,说明60 ℃以下的酶解温度对多糖损失率影响不显著。综合评价选择酶解温度45 ℃为宜。
图4 酶解温度对除蛋白率与多糖损失率的影响Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on protein removal rate and polysaccharide loss rate
2.2.1.4 酶解pH对除蛋白率及多糖损失率的影响 由图5可知,微酸的环境下除蛋白率相对较高,最优酶解pH为4.0～6.0,pH大于6.0除蛋白率开始显著下降,说明该木瓜蛋白酶在微酸环境下酶解效果较好,此结果与说明书中提供的酶解条件信息相符。多糖损失率随酶解pH升高无显著变化。综合评价选择酶解pH=5.0为宜。
图5 酶解pH对除蛋白率与多糖损失率的影响Fig.5 Effects of enzymatic hydrolysis pH on protein removal rate/polysaccharide loss rate
2.2.2 响应面法优化结果
2.2.2.1 回归模型的建立及显著性检验 采用Design-Expert8.0.6软件进行响应面设计,以除蛋白率(Y)为响应值获得响应面实验结果如表2。
表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Experimental design and results of response surface
对表2进行回归分析,得到回归方程为:
Y(除蛋白率,%)=92.03-3.31A+2.37B+2.54C-2.54D+0.13AB-0.80AC+1.25AD-1.87BC-0.38BD+0.50CD-10.75A2-2.23B2-5.38C2-5.98D2。
响应面实验设计对回归模型进行方差分析和显著性检验如表3。
表3 回归模型的方差分析结果Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model
2.2.2.2 响应面交互作用分析 结果见图6,B酶解时间与C酶解温度的等高线图形为椭圆形,且等高线相对较密集,响应面图形曲线趋势陡峭,表明B酶解时间与C酶解温度交互效应对响应值的影响显著(p<0.05);而A酶添加量与B酶解时间、A酶添加量与C酶解温度、A酶添加量与D酶解pH、B酶解时间与D酶解pH、C酶解温度与D酶解pH的等高线图形均为近似圆形,且等高线相对稀疏,结果表明A酶添加量与B酶解时间、A酶添加量与C酶解温度、A酶添加量与D酶解pH、B酶解时间与D酶解pH、C酶解温度与D酶解pH之间的交互效应对响应值的影响不显著。
图6 酶添加量、酶解温度、酶解时间和酶解pH交互作用的响应面图Fig.6 Response surface diagrams of enzyme addition amount,enzymatic hydrolysis temperature,enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis pH interaction
2.2.2.3 优化及其验证实验 通过软件Design-Expert V8. 0.6,得到提取的最佳工艺条件:酶添加量为0.90%,酶解时间为1.11 h,酶解温度为45.83 ℃,酶解pH为4.66，预测除蛋白率为93.16%。结合实际试验的情况,将提取条件进行修正:酶添加量为0.90%,酶解时间为1.1 h,酶解温度46 ℃,酶解pH为4.7。此条件下重复3次实验,得到除蛋白率为92.73%±0.13%,与预测值接近,说明该模型能够较好地反映酶-等电点法除蛋白的条件,并测定其多糖损失率为9.28%±0.12%,相比较2.1中酶法清除蛋白的结果,除蛋白率提高了25.19%,多糖损失率也降低了5.01%,结果说明酶-等电点法优化工艺后可以更高效的清除银杏落叶中的蛋白并降低多糖的损失率。
相比陈丽娟[14]研究银耳多糖的酶—等电点除蛋白法,本实验优化了该方法,除蛋白率提高了1.5%,多糖损失率升高1.41%,此结果可能由于银耳多糖与银杏落叶多糖成分的不同导致差异;相比陈静静等[11]研究银杏外种皮多糖酶法除蛋白,蛋白质清除率提高了40.16%,多糖损失率降低了6.97%,与其相比除蛋白率与多糖损失率都有优化。侯小涛等[19]的研究中,采用天然澄清剂进行蛋白清除,此方法虽然安全,但选择的最优多糖浓度为30 mg/mL,而本实验选择的多糖浓度可达到50 mg/mL,说明此方法可以更高效率的清除蛋白,从而节约成本。
3 结论
本实验确定酶法除蛋白的效果较好,多糖损失率相对较低,在食品加工方面更为安全,所以最适合可食性多糖的除蛋白。酶-等电点法除银杏落叶多糖中蛋白的最佳工艺条件为酶添加量为0.90%(以底物计算),酶解时间为1.1 h,酶解温度46 ℃,酶解pH为4.7。在此条件下,除蛋白率92.73%±0.13%,多糖损失率9.28%±0.12%。
