细点圆趾蟹蟹肉酶解液制备美拉德型蟹风味料工艺优化

刘佳梦,白 苗,张邵鸿,李统政,竹 琳,方旭波,,*,陈小娥,

(1.浙江海洋大学食品与医药学院,浙江舟山 316022; 2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室,浙江舟山 316022)

细点圆趾蟹(Ovalipespunctatus)隶属于梭子蟹科,圆趾蟹属,俗称“沙蟹”,盛产于我国黄、东海,是浙江沿海地区常见经济蟹种类,属广温、广盐性种类[1-2]。细点圆趾蟹常被加工成冷冻切蟹、冷冻蟹肉和蟹肉罐头等产品,由此带来大量的含蟹肉下脚料或碎蟹肉[3]。

美拉德反应(Maillard reaction)是食品热加工生产过程中常用的一种方法,其本质是蛋白质的氨基基团和还原糖的羰基基团相互作用,是一种常见的非酶褐变反应[4-5]。该反应的反应机理复杂,目前还不能完全解释清楚[6]。研究表明美拉德反应不仅可使产品产生特殊的色泽与风味,还在食品稳定性和货架期等方面起着重要作用[7-8]。目前对于细点圆趾蟹的研究主要集中在蒸煮液风味物质分析或酶解工艺优化方面,国内尚未有关于以细点圆趾蟹蟹肉酶解液为原料制备美拉德型蟹风味料的相关报道。胡小超等[9]以细点圆趾蟹酶解液为原料,利用正交试验确定蟹肉酶解肽-锌螯合最优条件,为细点圆趾蟹的高值化利用提供了依据;余辉等[10]利用电子鼻技术确定细点圆趾蟹蒸煮液浓缩前β-环糊精最佳添加量,对其真空浓缩工艺进行优化,在最佳条件下得到的浓缩汁蟹风味浓郁;卜俊芝等[11]研究细点圆趾蟹加工水煮液的营养成分及其风味物质,证明细点圆趾蟹适宜于制备以甜味和鲜味为主要特征的海鲜调味料。

本文以细点圆趾蟹蟹肉酶解液为原料,以感官评分为指标,考察反应温度、谷氨酸添加量、加热时间、pH和还原糖添加量对感官评分的影响,结合响应面试验确定最优美拉德反应条件,对蟹风味料氨基酸成分进行测定,并采用SPME-GC-MS(固相微萃取-气相-质谱联用)对蟹风味料挥发性风味物质进行分析,为美拉德型蟹风味料的开发及建立风味评价体系提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

细点圆趾蟹 购于舟山国际水产城;葡萄糖、木糖、谷氨酸 国药集团化学试剂有限公司;其他试剂均为分析纯。

PHS-3B精密pH计 上海精密科学仪器有限公司;HHS型电热恒温水浴锅 上海棱光技术有限公司;BS110S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;RE-52CS-1旋转蒸发 上海亚荣生化仪器厂;YXQ-LS-50G压力蒸汽灭菌器 上海科晓科学仪器有限公司;75 μm CAR/PDMS SPME(固相微萃取)装置 美国Supelco公司;Finnigan Trace气相色谱质谱联用仪 美国Finnigan公司;DB-WAX毛细管柱 30 m×0.25 mm×0.25 μm,美国J&W科学公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细点圆趾蟹蟹肉酶解液制备 参考李晶等[12]的实验方法。细点圆趾蟹取蟹肉后粉碎匀浆,液料比(v/w)3∶1,调节pH至7.5,加酶量1200 U/g,50 ℃水解3.5 h(加入胰蛋白酶1.2 h后,加入风味蛋白酶),酶的复合比为2∶1(胰蛋白酶∶风味蛋白酶)。酶解结束后迅速置于沸水浴中5 min灭酶,冷却至室温后5000 r/min条件下离心10 min,取上清液为细点圆趾蟹蟹肉酶解液。

1.2.2 美拉德型蟹风味料的制备 参考袁林等[13]的研究方法,在锥形瓶中加入蟹肉酶解液100 mL,添加一定量的谷氨酸和一定量的还原糖(木糖∶葡萄糖2∶1),调整至一定的pH,放入高压灭菌锅在一定温度下反应一段时间得到美拉德型蟹风味料,待其冷却后进行感官评定。

1.2.3 美拉德反应单因素试验 反应温度(110、115、120、125、130 ℃)、谷氨酸添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、加热时间(20、30、40、50、60 min)、pH(5、6、7、8、9)、还原糖添加量(1%、2%、3%、4%、5%)为单因素进行试验,研究不同因素对感官评分的影响。其余各因素固定为还原糖添加量3%、反应温度为115 ℃、反应时间为30 min、pH7、谷氨酸添加量3%、酶的复合比2∶1。

1.2.4 响应面法优化美拉德反应条件 在单因素试验的基础上,选择感官评分最佳时的固定还原糖和谷氨酸添加量,以感官评分为响应值,选取试验结果极差较大的反应温度、加热时间和pH为响应因素,采用软件Design-Expert V8.0.6设计三因素三水平的响应面分析试验,对蟹风味料美拉德反应条件进行优化,试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and level of response surface test

1.3 实验指标测定

1.3.1 感官评分指标 选择10名有相关感官评定知识且身体素质良好,视觉系统、嗅觉系统以及视觉系统正常的食品科学与工程专业学生。由这10名学生组成评定小组,以滋味、气味、外观三项为评价指标,对蟹风味料进行感官评分,评定时采用先看再闻后尝,满分100分,滋味40分、气味30分、外观30分,去除异常数值,取剩余数值平均值,平均值数值越高,说明蟹风味料品质越好,评分标准如表2。

表2 蟹风味料感官评分标准(分)Table 2 Sensory evaluation criteria for crab flavor(score)

1.3.2 SPME-GC-MS测定方法 参考叶梦迪等[14]实验方法进行。

1.3.2.1 SPME方法 取5 mL美拉德反应产物于20 mL专用顶空瓶中,50 ℃萃取30 min,然后将老化后的萃取头插入顶空瓶内,距液面1 cm,在50 ℃条件下吸附30 min,取出后与GC进样口相连,解析3 min后进行GC-MS分析。

1.3.2.2 GC条件 DB-WAX毛细管柱(规格:30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气:He(99.999%);柱流速:1.0 mL/min,不分流进样;柱温:初温35 ℃保持3 min,2 ℃/min升至150 ℃,然后再以4 ℃/min升至250 ℃,保持10 min;进样口温度:250 ℃。

1.3.2.3 MS条件 离子源:EI;离子源温度:230 ℃;四级杆温度:150 ℃;质量扫描范围:33～500 amu。

1.3.2.4 挥发性物质的鉴定 将样品色谱图中的每个峰与Willey和NIST数据库中的已知化合物的质谱数据进行比对,正反匹配度均大于850的物质予以报道。

1.3.3 氨基酸成分分析 按胡燃等[15]实验方法进行。取5 mL美拉德反应物于水解管内,加入6 mol/L盐酸5 mL,抽真空,使用酒精喷灯灼烧水解管分口,在110 ℃恒温干燥箱中水解24 h,冷却后过滤水解液,将其转移到50 mL容量瓶中定容。取滤液1 mL于5 mL容量瓶内,用40～50 ℃真空干燥器干燥后,残留物用1～2 mL水溶解,最后在50 ℃恒温干燥箱中蒸干,取1 mL pH2.2的缓冲液溶解后用氨基酸自动分析仪进行测定。

1.4 数据处理

每组试验重复三次,试验数据以“平均值±标准差”形式表示采用Origin Pro 9.1软件绘图,响应面试验利用软件Design Expert V8.0.6进行试验结果分析。

2 结果与分析

2.1 美拉德反应单因素试验

2.1.1 反应温度对美拉德反应产物的影响 反应温度是美拉德反应的重要因素。由图1可以看出,随着温度升高,感官评分在120 ℃时达到最高值,此时蟹风味浓郁,色泽棕黄。其原因可能是,温度较低时,美拉德反应产物香味没有完全挥发出来,蟹肉中原有的腥味也暴露出来,对产品风味和滋味产生较大影响;温度过高时,产生杂味物质,使产品带有不良风味。因此选择120 ℃比较适宜。

图1 反应温度对美拉德反应产物的影响Fig.1 Effect of reaction temperature on Maillard reaction products

2.1.2 谷氨酸添加量对美拉德反应产物的影响 由图2可知,在谷氨酸添加量1%～3%时,感官评分增幅明显,美拉德反应产物气味、滋味等都有显著提升;添加量超过3%,感官评分几乎不再变化。其原因可能是,美拉德反应在还原糖与氨基酸之间进行,由于试验中还原糖的添加量固定,过量的氨基酸无法和还原糖进行反应,对产物的感官评分影响较弱[16],因此选择3%的谷氨酸添加量作为最佳反应条件。

图2 谷基酸添加量对美拉德反应产物的影响Fig.2 Effect of the amount of glutamic acid addition on Maillard reaction products

2.1.3 加热时间对美拉德反应产物的影响 由图3可见,随着加热时间延长,感官评分呈现先增高再降低趋势。由感官评定可知,加热时间20～30 min,产品色泽变深,产品风味也愈发浓郁;在30 min时,美拉德反应产物色泽棕黄,蟹风味浓郁,反应物料基本反应完全,感官评分最高。超过30 min时,反应生成焦香味物质和挥发性气体,这些物质会掩盖蟹肉原有的特殊风味,影响感官评分。曹治云等人[17]研究发现美拉德反应温度较高,加热时间过长时会生成类黑精,该产物能够致癌。综合考虑,反应时间选择30 min较为适宜。

图3 加热时间对美拉德反应产物的影响Fig.3 Effect of heating time on Maillard reaction products

2.1.4 pH对美拉德反应产物的影响 由图4所示,随着pH变化,感官评分先上升后下降。其原因可能是,美拉德反应处于酸性环境时,氨基质子化,阻碍了羰氨反应的发生,故产品风味和色泽受到一定的影响;当美拉德反应处于碱性环境时,较酸性环境下能更顺利地进行,pH越高,生成的褐色物质越多,产品色泽加深[18-20]。相比之下,中性pH条件时,产品色泽棕黄,蟹风味浓郁,感官评分最高。因此pH7条件较为适宜。

图4 pH对美拉德反应产物的影响Fig.4 Effect of pH on Maillard reaction products

2.1.5 还原糖添加量对美拉德反应产物的影响 由图5可知,随着还原糖添加量的增加,感官评分呈先上升后下降的趋势。当还原糖添加量在1%～3%时,随着还原糖添加量的增加,香气逐渐浓郁,色泽加深,感官评分升高;超过3%时,评分开始下降,其原因可能是,未能参与羰氨反应的还原糖在高温下产生苦味物质对口感产生影响[21]。因此选择还原糖添加量为3%作为最佳反应条件。

图5 还原糖添加量对美拉德反应产物的影响Fig.5 Effect of reducing sugar addition on Maillard reaction products

2.2 响应面法优化美拉德反应条件

2.2.1 回归模型的确定及响应面分析 利用Design Expert V8.0.6对表3的响应面试验结果进行回归拟合,得到感官评分模型的二次多项回归方程为:

表3 响应面法优化美拉德试验条件设计及结果Table 3 Optimization of Maillard test condition design and results by response surface methodology

Y=79.39+4.35A+2.44B+1.27C+1.33AB-0.24AC-1.14BC-5.32A2-6.60B2-7.57C2

表4 感官评分回归模型Table 4 Sensory score regression model

2.2.2 响应面图分析 若响应面坡度陡峭,则说明响应值对该因素变化敏感,两者间交互作用越强;若响应面坡度相对较平缓,说明该因素对响应值影响不大,两者间交互作用较弱。研究任两个因素交互作用对蟹风味料感官评分时,固定另一因素在0水平,从而得到三维响应面图。如图6～图8所示,观察可得:图6、图7中A轴即反应温度轴上响应面值相比加热时间和pH更为陡峭,因此反应温度因素对感官评分影响更大;图8中C轴即pH轴上响应面坡度更为平缓,说明感官评分对加热时间的变化更为敏感。响应面图分析结果与方差分析结果一致:A(反应温度)>B(加热时间)>C(pH)。

图6 反应温度与加热时间对感官评分影响的响应面Fig.6 Response surface plot for the effect of reaction temperature and heating time on sensory score

图7 反应温度和pH对感官评分影响的响应面Fig.7 Response surface plot for the effect of reaction temperature and pH on sensory score

图8 加热时间和pH对感官评分影响的响应面Fig.8 Response surface plot for the effect of heating time and pH on sensory score

2.2.3 验证试验结果 运用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行优化预测,得出在试验因素水平范围内预测蟹肉酶解液美拉德反应最优工艺条件为,反应温度122.26 ℃,加热时间33.76 min,pH7.09,感官评分预测值为80.49分。根据实际可行情况调整条件为,反应温度122 ℃,加热时间33 min,pH7,进行3次验证试验,实际测得的感官评分为(79.61±0.12)分,与模型预测值较接近,相对偏差仅为1.09%,表明用响应面法优化得到的蟹肉酶解液美拉德反应条件可靠。

2.3 氨基酸分析

由表5可以看出,在最优美拉德反应条件,即122 ℃下,调整pH至7,加热33 min,制得的蟹肉酶解液美拉德反应产物中共检测出17种氨基酸,氨基酸总含量为26.718 g/100 g,其中必需氨基酸含量为9.272 g/100 g,占总氨基酸含量的34.70%,甜味氨基酸和鲜味氨基酸含量占总氨基酸含量的85.98%。各种氨基酸根据其特征呈现不同的风味,其中亮氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸占总氨基酸含量的14.93%,能使海鲜调味料香气浓郁[22]。

表5 蟹肉酶解液美拉德反应物氨基酸含量分析Table 5 Analysis of amino acid content of Maillard reaction product with crab hydrolysate

2.4 挥发性物质研究

经优化的最优实验条件下制得蟹肉酶解液美拉德反应产物,采用SPME-GC-MS对其进行测定,测得其总离子流程图如图9所示,挥发性物质组成及相对含量见表6。

图9 蟹风味料挥发性物质总离子流程图Fig.9 Crab flavor volatiles total ion flow chart

表6 美拉德型蟹风味料SPME-GC-MS鉴定结果及分析Table 6 SPME-GC-MS identification result and analysis of Maillard crab flavor

续表

2.4.1 醛类物质 醛类物质占总挥发性物质含量的1.858%。醛类物质阈值较低,因而对产品风味有较大影响。醛类物质通常来自于脂肪氧化,具有脂肪香味[23],其中含量最高的壬醛具有柑橘、玫瑰等香气,有较强的油脂气味[14]。辛醛、壬醛和己醛主要来源于不饱和脂肪酸,如亚麻酸、油酸、花生四烯酸等的氧化[24],本实验所采用的细点圆趾蟹是常见海产蟹类,含有多种不饱和脂肪酸,较易氧化产生辛醛、壬醛和己醛此类物质。

2.4.2 酮类物质 酮类物质占总挥发性物质含量的3.625%。酮类贡献果香和甜花香风味,通常随着碳链的增长贡献出更强的花香特征[25],其中烯酮类能够提供浓烈的似玫瑰叶香[26]。又因酮类物质阈值略高于醛类物质,因此相较而言此类物质对于蟹风味料的风味贡献值也较大。

2.4.3 醇类物质 醇类物质占总挥发性物质含量的5.967%。醇类一般呈香甜味、花香味或土腥味,但醇类物质阈值高,对食品风味贡献较小,挥发性物质中所检测出来的醇类基本来源于脂肪氧化[27],其中饱和醇由于阈值较高,几乎不对产品风味起影响作用;某些不饱和醇类能对产品风味起到一定的贡献,但其贡献值较低可忽略不计。

2.4.4 芳香类物质 芳香类物质占总挥发性物质含量的5.527%。芳香类物质一般是Tyr、Phe等苯环氨基酸的降解产物,其中苯酚对产品风味有一定的不良影响,但其相对含量较低,一般来自环境污染。

2.4.5 含N/S/O杂环化合物 含N/S/O杂环化合物占总挥发性物质含量的14.945%,其中吡嗪类物质所占总比例较高,尤以2,6-二甲基吡嗪含量最高,达到7.656%,占到该类杂环化合物的52.25%。该物质阈值较低,能够为蟹风味料提供宜人的烤香、坚果和海鲜肉香味[28-29]。此外,吡啶类物质占该类杂环化合物的3.23%,但吡啶类物质阈值极低,低含量即能产生令人愉悦的味道。故含N/S/O杂环化合物对蟹风味料风味贡献较大。

2.4.6 其他化合物 其他化合物主要是指酯类和碳氢类物质,此类物质阈值较高,对产品风味影响较小。这些物质共占总挥发性物质的29.548%,其中乙酸甲酯比重最高,占总挥发性物质的10.96%,酯类物质能为食品提供柔和的水果香味和花香味[30],使得蟹风味料具有更加丰富的风味。碳氢类物质一般被认为对香气无特殊贡献,但有些可能会形成杂环化合物的重要中间体,有助于提高整体风味[31]。

3 结论

通过单因素和响应面法对细点圆趾蟹蟹肉酶解液美拉德反应条件进行优化,得出最优美拉德反应条件为反应温度122 ℃,谷氨酸添加量3%,加热时间33 min,初始pH7,还原糖(木糖∶葡萄糖=2∶1)添加量为3%,感官评分(79.61±0.12)分,与模型预测值80.49分,相对偏差值仅1.09%,表明结果真实可靠。在此条件下制备的蟹风味料,滋味鲜美,蟹风味浓郁,色泽棕黄。对蟹风味料挥发性物质进行SPME-GC-MS检测可以得出,其特征性风味物质可能为吡嗪类物质,该类物质阈值较低,能为蟹风味料提供怡人的烤肉香味和海鲜风味。因此,美拉德反应不仅能够改善蟹肉酶解液风味,也为新型海鲜调味料的开发提供了依据。