等电点法纯化太平洋鳕鱼皮胶原蛋白及其结构特性研究

刘凤鸣,李八方,侯 虎

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

我国是渔业大国,2014年鱼类总产量即已接近4000万吨[1]。水产品加工业的快速发展,随之而来的是加工中产生的大量副产品,如鱼皮、鱼骨、鱼鳞等。大量副产品未经处理便被随意丢弃,不仅造成了环境污染,还造成了生物资源的浪费。而这些副产品中,以鳕鱼皮为例,淑英等[2]发现,鳕鱼皮干物质中有50%以上为胶原蛋白。且鳕鱼属于深海鱼类,污染小,是生产胶原蛋白的优质原料。

在胶原蛋白的生产过程中,纯化是极其重要的一步,纯度高的胶原蛋白才能应用于医药领域。传统的胶原蛋白纯化方法主要是盐析法,常用的盐类是氯化钠、硫酸铵等。盐析法的原理在于,加入盐溶液后,盐分子所带的电荷会中和胶原蛋白分子表面的电荷,使胶原蛋白分子之间的静电相互作用降低,逐渐聚集并沉淀下来[3]。盐析法具有回收率高、无污染的优点,且不会对胶原蛋白的三螺旋结构产生影响,因此一直被用于胶原蛋白的纯化领域。但是盐的加入会使后期的透析时间大大延长，一般盐析后需要透析3～4 d,才能保证终产品不受盐和酸的影响。任海涛等[4]采用盐析法纯化鼠尾胶原蛋白,需在超纯水中持续透析3 d,每天换液3次。

等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最低,且不同蛋白质具有不同的等电点进行分离的方法。等电点沉淀法具有效率高、专一性强等特点,且不需要后期长时间的透析,因此应用广泛。例如被用于牛奶乳清蛋白[5]的分离纯化,藻类蛋白的提取[6],甚至是污水蛋白的回收[7],但关于其在胶原蛋白回收纯化中的应用鲜有报道。

因此,本文采用等电点沉淀法纯化鳕鱼皮胶原蛋白,以期为一种新的、高效的胶原蛋白纯化方法提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鳕鱼皮 青岛三洋水产品加工公司;氢氧化钠、氯化钠、冰醋酸、溴化钾 分析纯,国药集团;鼠尾Ⅰ型胶原蛋白 美国Sigma公司;蛋白质Marker 美国New England生物技术有限公司;BCA法总蛋白测试试剂盒 南京建成生物工程研究所。

ZS90型Zeta电位分析仪 英国Malvern Instruments公司;Powerpac型电泳仪 美国Bio-Rad公司;Powerwave XS型酶标仪 美国Biotek公司;UV-2102PC型紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;200SXV型傅里叶变换红外光谱仪 美国Nicolet公司;D8 Advance型X-射线衍射仪 德国Bruker公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胶原粗溶液和胶原蛋白冻干品的制备 取新鲜洁净鳕鱼皮,用干净剪刀剪成1 cm×1 cm的块状,按照1∶60 g/mL加入冷藏0.08 mol/L的氢氧化钠溶液,于4 ℃环境下采用磁力搅拌器搅拌12 h。后以冷藏蒸馏水清洗至中性。在按料液比1∶60 g/mL,乙酸浓度为0.55 mol/L的条件,于4 ℃搅拌酸提至大部分鱼皮溶解,4 ℃环境下9000 r/min(8603×g)离心30 min后取上清液即为胶原蛋白粗提液。取一部分胶原粗溶液,加入预先磨好的氯化钠粉末至终浓度为1.5 mol/L。后采用0.5 mol/L乙酸溶液搅拌复溶12 h,采用500 Da透析袋,隔6 h换一次透析液(蒸馏水),连续透析3 d后,冻干得到经盐析法纯化得到的胶原蛋白干品。

1.2.2 溶解度的测定 参考Pal等[8]方法测定样品的溶解度。首先,将经盐析法纯化得到的胶原冻干品溶解于0.5 mol/L乙酸中配制成浓度为6 mg/mL的胶原溶液。使用6 mol/L的氢氧化钠或盐酸溶液将样品的pH调节至1～10。然后,将样品溶液在4 ℃下搅拌30 min后在4 ℃下8603×g离心30 min。收集上清液,计算相对溶解度RS:

其中,Ps为上清液的蛋白质浓度;Pm是最高的蛋白质浓度。

1.2.3 Zeta电位的测定 参照程海明等[9]方法进行。将鳕鱼皮胶原蛋白冻干品溶于0.5 mol/L乙酸中配成0.5 mg/mL的胶原溶液。使用1.0 mol/L的硝酸溶液和1.0 mol/L的氢氧化钾溶液将上述溶液的pH调节至2～11。在4 ℃下测定样品的Zeta电位值。样品的等电点为Zeta电位值为零时对应的pH。

1.2.4 等电点沉淀法纯化胶原蛋白粗提液 将1.2.1中提取得到的胶原粗溶液使用浓度为5 mol/L的氢氧化钠和乙酸溶液调至pH7.0左右,静置3 h后,4 ℃环境下8603×g离心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液复溶后透析48 h,期间每隔6 h换一次预冷透析液(蒸馏水),最后冻干得到等电点法纯化胶原蛋白。

1.2.5 SDS-PAGE分析胶原纯度 对等电点纯化后的胶原进行SDS-PAGE分析。采用5%的浓缩胶和7.5%的分离胶。采用0.6 mol/L的Tris-HCl缓冲液(含有2%的SDS、0.1%的溴酚蓝、25%的甘油和14.4 mol/L的β-ME,pH为6.8)为样品缓冲液;染色液为0.1%的考马斯亮蓝溶液(考马斯亮蓝∶甲醇∶冰醋酸=9∶9∶2,v/v);脱色液按照水∶甲醇∶冰醋酸=8∶1∶1的比例配制。取冻干样品1 mg溶于5%的SDS溶液中,按照1∶4(样品:缓冲液1)的比例加入样品缓冲液,沸水浴煮5 min,8603×g离心5 min后取10 μL上样。同时取10 μL蛋白质Marker作为分子量的参考,10 μL上鼠尾Ⅰ型胶原作为对照。电泳过程采用直流恒压电源,电压为100 V。

1.2.6 结构特性分析 采用X-射线衍射、傅里叶红外光谱和紫外吸收光谱对等电点纯化后得到的胶原进行结构特性分析。

对样品进行X-射线衍射分析。射线源为Cu靶Kα辐射,电压为40 KV,电流为40 mA。扫描角度5°～50°(2θ),扫描速度为4°/min。扫描结果采用Origin 8.5作图。

对样品进行傅里叶红外光谱分析。将溴化钾烘干至恒重,取适量用玛瑙研钵充分研磨,后用压片机压片,在500～4000 cm-1范围内扫描,扫描的结果作为背景。后取适量等电点纯化胶原冻干品和烘干溴化钾充分研磨混匀(大约1∶100 g/g),在同样波长范围内扫描,分辨率为2 cm-1,扫描次数32次。

对样品进行紫外吸收光谱分析。取冻干后的等电点纯化胶原,溶解于0.5 mol/L的乙酸溶液中,配制成1 mg/mL的溶液。取0.5 mol/L的乙酸溶液用于基线的测定。采用紫外可见分光光度计在200～400 nm范围内以中速扫描。

1.2.7 等电点沉淀法纯化工艺的研究 采用不同沉淀时间、不同沉淀pH、不同胶原浓度,对胶原粗溶液进行纯化,以确定最优纯化工艺。

固定沉淀pH为7.0、胶原浓度为6 mg/mL,将沉淀时间分别定为0、1、2、3、6、24 h,4 ℃环境下8603×g离心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液复溶。测定复溶液的胶原蛋白浓度和总蛋白浓度,计算回收率和纯度。

固定沉淀时间为3 h、胶原浓度为6 mg/mL,将胶原粗溶液的pH分别调至6.4、6.6、6.8、7.0、7.2,4 ℃环境下8603×g离心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液复溶。测定复溶液的胶原蛋白浓度和总蛋白浓度,计算回收率和纯度。

固定沉淀时间为3 h、沉淀pH为7.0,将胶原粗溶液的浓度分别调至2、4、6、8、10 mg/mL,4 ℃环境下8603×g离心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液复溶。测定复溶液的胶原蛋白浓度和总蛋白浓度,计算回收率和纯度。

1.2.8 回收率和纯度的计算

回收率(%)=(复溶液羟脯氨酸含量/胶原粗溶液的羟脯氨酸含量)×100

纯度以复溶液羟脯氨酸含量/复溶液总蛋白含量表示。

1.2.9 羟脯氨酸含量和总蛋白含量的测定 根据Sun等[10]的方法测定羟脯氨酸的含量。首先,取0.5 mL液体样品加入0.5 mL的6 mol/L盐酸(固体样品取1～2 mg,加入1 mL的6 mol/L盐酸)在110 ℃水解8 h,然后将水解产物彻底转移并调至中性。使用10 μg/mL羟脯氨酸溶液作为标准溶液。经计算，羟脯氨酸标准曲线方程为：y=0.0939x+0.0129(R2=0.9991)。 取1 mL样品溶液和标准溶液,加入1.5 mL无水乙醇和1 mL氯胺T,然后,在每个管中加入1 mL高氯酸反应5 min。最后,加入1 mL对二甲基氨基苯甲醛,置于60 ℃水浴中静置20 min。冷却反应溶液后用酶标仪测定560 nm处的吸光值。总蛋白测定根据试剂盒采用BCA法。

1.3 数据处理

所有实验均进行三次平行实验,每次实验平行测定三次。结果均采用Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 溶解度曲线

如图1所示,鳕鱼皮胶原在pH1～3时都是高度可溶的,并且在pH=3时溶解度最高。随着pH的升高(pH3～pH7),溶解度急剧下降,并且在pH=7时溶解度最低。lvarez等[11]报道,当胶体系统接近其等电点时,分子的净电荷将接近零。在这种情况下,分子间的静电排斥最小,分子将发生聚集和沉淀。也就是说,蛋白质在其等电点时具有最小的溶解度。因此,鳕鱼皮胶原的的等电点在7左右。此外,从pH9～11,样品的溶解度有增加,Jongjareonrak等[12]报道,当pH远离等电点时,胶原分子将携带更多的净电荷,胶原分子之间的排斥力增高,溶解度也随之增高。

图1 pH对胶原蛋白溶解度的影响Fig.1 Effects of pH on the solubility of collagen from pacific cod skin

2.2 Zeta电位

如图2所示,胶原蛋白分子的电荷在pH2～6时为正,在pH7～10时为负,并且在pH=6.83时净电荷为零。根据先前的报道[13],在特定的pH下,胶原分子所带的正电荷将等于负电荷,该pH即为胶原蛋白的等电点。因此,样品的等电点为6.83,该结果与溶解度的结果一致。样品的等电点处于弱酸性,这可能是因为胶原中谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸含量高[14]。

图2 Zeta电位分析Fig.2 Zeta potential analysis of collagen

2.3 SDS-PAGE

根据图3,图谱中条带清晰,无杂带出现。这表示等电点纯化得到的样品纯度较高,等电点纯化法可以作为一种有效的纯化方法。且样品的电泳图谱与鼠尾Ⅰ型胶原类似,均由至少两种不同的α多肽链(α1和α2)组成。这些α链的分子量约为135 kDa。由图3可以看出,α1带的强度约为α2带的两倍。因此,鳕鱼皮胶原蛋白的分子组成可表示为(α1)2α2。此外,在图中还可以观察到二聚体(β链)和三聚体(γ链),它们代表了胶原蛋白的分子间和分子内交联[15]。这些β链的分子量约为245 kDa,而γ链的分子量一般大于245 kDa。样品和鼠尾Ⅰ型胶原的电泳图谱之间没有实质性差异,这也证明了胶原的亚基或交联未受pH的影响。

图3 等电点纯化胶原的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE pattern of collagen purified by isoelectric precipitation method注:M为高分子蛋白marker泳道; A为等电点纯化胶原泳道;B为鼠尾Ⅰ型胶原泳道。

2.4 结构性质分析

2.4.1 等电点纯化胶原的X-射线衍射(X-RD)分析 根据图4,等电点纯化得到的胶原具有两个主要的衍射峰。对应的衍射角(2θ)分别为7.4°,22.3°。根据布拉格方程d(Å)=λ/2sinθ(其中λ是X射线波长,θ 是布拉格衍射角)可以计算出衍射峰对应的最小重复面间距d。计算出d值分别为11.93Å和3.98Å。Giraud-Guille等[16]研究表明,第一个衍射峰反映了胶原纤维分子链之间的距离,其值在12Å左右，第二个衍射峰反映了由胶原纤维引起的弥漫性散射,其值在4Å左右。该结果与文献报道一致,说明等电点纯化胶原的三螺旋结构仍保持完整。

图4 等电点纯化胶原的X-射线衍射Fig.4 X-ray diffraction of collagen purified by isoelectric precipitation method

2.4.2 等电点纯化胶原的傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析 由图5所示,等电点纯化得到的样品具有五个典型的酰胺带。酰胺A带出现在3308 cm-1。正如Doyle等[17]报道的那样,酰胺A带与N-H伸缩振动有关,发生在3400～3440 cm-1范围内,最终在氢键形成后转移到3300 cm-1附近,这有助于维持胶原蛋白的三螺旋结构。此外,分别在2933和1655 cm-1处观察到酰胺B带和酰胺I带。通常出现在1550～1600 cm-1范围内且主要与N-H弯曲振动有关的酰胺Ⅱ带[18]出现在1543 cm-1。由C-N伸缩振动产生的酰胺III带出现在1232 cm-1。上述发现与其他相关研究相似[19-20]。

图5 等电点纯化胶原的傅里叶变换红外光谱Fig.5 FTIR spectra of collagen purified by isoelectric precipitation method

2.4.3 等电点纯化胶原的紫外吸收光谱分析 如图6所示,等电点纯化后的胶原在234 nm处有最大紫外吸收,这是胶原的典型吸收波长[19]。根据Sun等[20]的研究,紫外吸收与-COOH,-CONH2基团和C=O的n→π*跃迁有关。此外,苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸分别在250、270和280 nm附近有最大紫外吸收[21]。然而,该样品在275 nm处仅有微小的吸收,而在280 nm处没有吸收,这表明样品中含有微量的酪氨酸但没有色氨酸,这也进一步证明样品的纯度很高。

图6 等电点纯化胶原的紫外吸收光谱Fig.6 Ultraviolet absorption spectrum of collagen purified by isoelectric precipitation method

2.5 等电点沉淀最优工艺的确定

由图7A可以看出,随着时间的延长,回收率和纯度均呈现出先上升后趋于平稳的趋势。在6 h时,回收率达到85%左右。此时羟脯氨酸/总蛋白的比值为0.0875。综合两个指标,选择6 h作为最适沉淀时间。由此也可以看出,等电点沉淀较盐析沉淀在时间上有较大优势。而对于工业化生产来说,时间的降低就相当于成本的降低。

由图7B可以看出,随着pH的升高,回收率和纯度均呈现出先上升后下降的趋势。在pH=6.8时,回收率最高,为90.05%,这个结果也与溶解度和Zeta电位的结果一致。此时羟脯氨酸/总蛋白的比值为0.092。纯度在pH=7.0时达到最大,但此时回收率有明显的下降。综合两个指标,当工业要求产品纯度较高时,选择pH=7.0作为最适pH;当要求回收率最大时,选择pH=6.8作为最适pH。

由图7C可以看出,随着胶原蛋白浓度的升高,回收率和纯度均呈现出先上升后下降的趋势。在胶原浓度为6 mg/mL时,回收率和纯度均达最高,回收率为85.12%,此时羟脯氨酸/总蛋白的比值为0.089。因此选择6 mg/mL作为最适胶原浓度。对于胶原浓度大于6 mg/mL后出现的下降现象,推测可能是因为此时胶原溶液浓度过高,溶液的黏度过大,导致酸或碱的加入很难中和胶原分子所带的电荷。

图7 不同沉淀时间、pH和胶原浓度对回收率和纯度的影响Fig.7 Effects of sediment time,pH and collagen concentration on the recovery yield and purity注：A：沉淀时间；B:pH；C：胶原浓度。

在上述最优条件(pH6.8,沉淀6 h,6 mg/mL)的基础上进行了验证实验,回收率为了85.62±1.01%,羟脯氨酸含量/总蛋白含量为0.0872。若按羟脯氨酸和胶原蛋白间的换算系数11.1计算,纯度可达96.79%±1.12%。因此,该优化条件准确。

3 结论

溶解性曲线和Zeta电位法联合确定了鳕鱼皮胶原蛋白的等电点。利用等电点沉淀的原理纯化了鳕鱼皮胶原蛋白。结果显示样品的纯度较高,且三螺旋结构保持完整。这说明等电点纯化法可以作为一个有效的办法应用于鳕鱼皮胶原蛋白的纯化。优化结果显示，在pH=6.8，胶原蛋白浓度为6 mg/mL时，沉淀6 h，回收率能达到85.62%±1.01%，羟脯氨酸含量/总蛋白含量能达到0.087。 等电点纯化法能大大减少后期透析的时间,节约了时间成本,这将有利于胶原蛋白的工业化生产。