NaCl和pH对普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌碳源代谢能力的影响

单 珂,郭全友,李保国

(1.上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093; 2.中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090)

水产品由于水分和蛋白质含量高等特点,极易在贮运期间发生腐败。研究表明,水产品中的特定腐败菌(Specific spoilage organism,SSO)是导致水产品腐败变质的主因,SSO能分解糖类、蛋白质、脂肪等,通过代谢产生小分子物质,生成难闻的异味,缩短产品货架期和流通半径[1-2]。微生物不断从外界吸收碳源、氮源、无机盐和微量元素等营养物质,维持自身生长[3]。在pH、温度、盐分、水分活度和抑菌剂等胁迫作用下,微生物通过不断消耗能量来维持内部平衡,若超出其耐受范围,可导致细菌死亡[4]。从能量代谢角度分析不同胁迫条件下微生物生长状况,对于研发食品保藏和安全控制具有重要意义。微生物代谢分析方法主要有核磁共振技术[5]、微量量热法[6]和微生物培养法[7]等。在维持微生物生长的要素中,碳源是维持微生物生长的重要能源,不但对菌株生长起重要作用,对其胞内酶的合成有选择性诱导作用,同时还是生物体代谢的底物,其存在种类和数量对微生物生长极其重要[8]。此外,碳源还在微生物的许多生理代谢过程中扮演着调节因子的角色,且存在复杂的碳源感应系统[9]。因此,研究环境胁迫下微生物碳源代谢及动力学,对于采用靶向抑菌技术延长产品货架期具有重要意义。

BIOLOG技术是研究微生物碳代谢特征的有效方法之一,通过微生物对底物代谢形成可识别代谢指纹,分析微生物对单一碳源的代谢能力,具有方便省时的特点[10]。微生物不同,其利用的优势碳源也存在差异,如假单胞菌的优势碳源是有机酸和氨基酸[11],葡萄糖是大肠杆菌的优势碳源[12]。环境因子的改变也会改变微生物对碳源的利用效果[13],同时微生物存在碳代谢抑制(Carbon catabolite repression,CCR)机制[14],有助于微生物针对环境条件变化做出应激响应,并进行自我调整,从而提高竞争力,此种机制在不同物种间存在差异[15]。轻腌大黄鱼是一种主要大黄鱼加工品,具有低盐、水分高和弱酸的特点,腐败菌极易繁殖,导致产品腐败和货架期较短。课题组前期在对轻腌大黄鱼低温(5 ℃)贮藏过程品质和货架期终点菌相进行研究的基础上,分离出普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌两种优势菌。虽已对低温(5 ℃)和室温(25 ℃)下普通变形杆菌的碳源代谢能力进行研究[16],但轻腌大黄鱼主要抑菌因子(NaCl和pH)对优势菌碳源代谢的影响少见报道。

本文以源自轻腌大黄鱼的优势菌普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌为对象,使用BIOLOG GENⅢ微孔板培养法,测定不同NaCl和pH胁迫作用下其生长状况及71种碳源代谢能力的差异性,旨在为靶向抑制腐败菌生长、优化产品配方,深入探究环境因子与其代谢机制的关系提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株来源:5 ℃下轻腌大黄鱼储藏29 d到达货架期终点,终点菌相经MIDI气相鉴定仪及16S rRNA测序,确定其优势菌株为普通变形杆菌(Proteusvulgaris)(序列号:KY684257)和蜂房哈弗尼菌(Hafniaalvei)(序列号:KY684258),比例分别为58.9%和35.9%[17],菌株-80 ℃冰箱冻藏,用前活化备用。营养琼脂培养基(BR)、营养肉汤培养基(BR)、氯化钠(AR)、NaOH(AR)、HCl(AR) 上海市国药集团化学试剂有限公司;Biolog IF-A接种液、Biolog GENⅢ板 美国Biolog公司。

MIR-153型高精密度低温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;SW-CJ-1FB型超净台上海博迅实业有限公司医疗设备厂;pHS-3C型pH测定仪 上海仪电科学仪器股份有限公司;YXQ.SG41.280A型手提式压力蒸汽灭菌锅上海医用核子仪器厂;Biolog GEN3微生物半自动鉴定仪美国Biolog公司;DW-86L626型超低温保存箱 青岛海尔特种电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 接种设计 基于轻腌大黄鱼低盐(盐分<6%)和pH近中性的特点[18],将BIOLOGIF-A接种液按设置的浓度梯度调节到相应水平,分别为NaCl:1%、2%、3%、4%和5%(各组别pH均为7.0),pH:5.0、5.5、6.0、6.5和7.0(不含NaCl),其中,pH为7.0组即为对照组。用接种环蘸取保藏的普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌菌液分别接种于营养肉汤培养基中,25 ℃培养24 h得到活化的菌液,之后用接种环在营养琼脂平板上划线,25 ℃培养24 h得到单菌落,参照BIOLOG GEN Ⅲ板操作说明,用接菌棒挑取菌落至IF-A接种液中,上下滑动使得菌体分散,将菌悬液浓度调至90%～98%,用八通道电动移液器将菌悬液加入到GEN Ⅲ微孔板中,5 ℃恒温培养,采用OmniLog读数仪读取数据,每隔12 h测一次吸光度(OD590 nm),共10 d。

1.2.2 碳源利用能力的测定

1.2.2.1 丰富度指数的计算 丰富度指数(Number of positive wells)是指菌株总的碳源利用种数,即Ci-R>0.25的孔数,Ci为除对照孔外各孔的OD590 nm值,R为对照孔OD590 nm值[19]。

1.2.2.2 平均颜色变化率的计算 用每孔平均颜色变化率(Average well color development,AWCD)来表示微生物对不同碳源的代谢能力,可描述微生物代谢强度及平均活性,颜色变化的深浅即代表该种碳源的利用强弱,代表各孔的平均颜色响应[20]。公式为:

式(1)

式中:R为对照孔OD590 nm值;C为含有碳源孔OD590 nm值;n为碳源孔数。

1.2.2.3 不同种类碳源利用能力分析 BIOLOGGENⅢ板内包含71种碳源,参照董秀黄[21]的分类方法将其分为6大类,分别为:糖类31种、氨基酸类10种、羧酸类15种、己糖磷酸类8种、酯类3种、其他类4种。

对不同种类碳源的利用能力以利用积分面积S表示,按照碳源分类分别计算,碳源利用面积公式为[4]:

式(2)

式中:Vti为ti时的OD590 nm值。

1.3 数据处理

数据采用软件Microsoft Excel和IBMSPSS Statistics20(美国IBM公司)进行分析处理,主成分分析(Principal component analysis,PCA)采用SPSS进行,采用Origin 9(美国Origin Lab公司)软件对数据进行作图。采用独立样本T检验和单因素ANOVA分析方法进行差异显著性检验(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 NaCl浓度和pH对菌株碳源代谢丰富度指数的影响

利用丰富度指数来表示微生物能够代谢的碳源总种数,NaCl浓度和pH对两株菌碳源利用丰富度指数变化的影响如图1～图2所示。

图1 NaCl浓度对两株菌碳源代谢丰富度指数影响Fig.1 Effect of NaCl concentration on basis number of positive wells of carbon source metabolism of the two strains注:图中显著性表示同一NaCl或pH下两株菌 之间的显著性差异比较,相同字母代表无显著性差异, 不同字母代表差异显著(p<0.05);图2同。

图2 pH对两株菌碳源代谢丰富度指数影响Fig.2 Effect of pH on basis number of positive wells of carbon source metabolism of the two strains

由图1可知,NaCl浓度对普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌丰富度指数的影响趋势相同,随着NaCl浓度的增加均呈下降趋势,NaCl浓度为0时,两株菌能利用的碳源种类最多,均为23种;当NaCl浓度增加到3%时,丰富度指数急剧下降到0,表明此时NaCl已抑制了两种微生物的碳源代谢。NaCl浓度为0～1%时两株菌之间无显著差异,NaCl浓度为2%时,蜂房哈弗尼菌丰富度指数大于普通变形杆菌,差异显著(p>0.05),NaCl>3%时,两株菌的生长受到强烈抑制,丰富度指数为0。

由图2可知,当pH为5.0时,普通变形杆菌只能利用13种碳源,蜂房哈弗尼菌能利用28种碳源,随着pH的升高,普通变形杆菌的丰富度指数呈上升趋势,蜂房哈弗尼菌则总体变化不大,在pH为7.0时,普通变形杆菌能利用23种碳源,蜂房哈弗尼菌能利用26种碳源。此结果表明,低酸环境能在一定程度上抑制普通变形杆菌生长,与曹海军等[22]的研究结果趋势相同,普通变形杆菌在pH4.0～5.5生长缓慢;蜂房哈弗尼菌则受pH影响不大,甘未祺[23]研究了pH对蜂房哈弗尼菌群体感应信号分子基因表达的影响,发现在pH5.0、6.0和7.0之间无显著性差异,与本文结果相对应。由此可知,蜂房哈弗尼菌对低pH的耐受性高于普通变形杆菌。

2.2 NaCl浓度和pH对菌株平均颜色变化率的影响

探究不同压力条件下菌株对于碳源的总体代谢能力,利用平均颜色变化率AWCD来衡量其变化趋势[24],不同NaCl和pH条件下普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌总体碳源代谢的AWCD变化曲线见图3～图6。

图3 普通变形杆菌在不同NaCl浓度下总体碳源代谢情况Fig.3 Carbon metabolism of Proteus vulgaris under different concentration of NaCl

图6 蜂房哈弗尼菌在不同pH下总体碳源代谢情况Fig.6 Carbon metabolism of Hafnia alvei under different pH values

由图3～图6可知,随着时间的变化总体碳源利用呈“S”形曲线,两株菌的总体变化趋势相近,NaCl对两种腐败菌的总体碳源代谢能力影响更大。图3为NaCl浓度对普通变形杆菌碳源代谢的影响,与对照组相比,普通变形杆菌碳源代谢能力随着NaCl浓度的升高,抑制效果逐渐增加,当NaCl浓度为1%～2%时,细菌的延滞期较短,约为40 h,NaCl浓度升至3%时,两株菌的生长受到明显抑制,延滞期明显延长,在5%条件下几乎停止生长,AWCD值接近0。图5为NaCl浓度对蜂房哈弗尼菌碳源代谢的影响,趋势与图3普通变形杆菌相似,随着NaCl浓度的增大,碳源代谢能力下降,延滞期延长,5% NaCl浓度下AWCD值接近0,延滞期约为120 h。孔西曼等[25]研究了不同浓度NaCl对蜂房哈弗尼菌分泌信号分子AHLs的影响,在3%的NaCl浓度下蜂房哈弗尼菌的生长受到了严重抑制,NaCl浓度为4%、5%时,均未出现细菌生长,此结果与本研究相同。

图5 蜂房哈弗尼菌在不同NaCl浓度下总体碳源代谢情况Fig.5 Carbon metabolism of Hafnia alvei under different concentration of NaCl

图4和图6显示,pH的变化对两株菌的影响小于NaCl,随着pH的下降,普通变形杆菌的碳源代谢能力受到一定程度抑制,但在pH下降到5.0时依然能够生长,AWCD值达到0.147;pH的变化对蜂房哈弗尼菌的碳源代谢能力影响稍小于普通变形杆菌,在pH为5.0时其AWCD值达到了0.2,高于普通变形杆菌。郭全友等[4]研究pH对鱼源莓实假单胞菌生长的影响发现,15 ℃时pH5.0和6.0最大比生长速率比较接近,25 ℃时pH6.0的最大比生长速率远大于pH5.0,33 ℃时两个pH则对菌的生长起抑制作用,表明温度也会影响细菌对pH的耐受性。

图4 普通变形杆菌在不同pH下总体碳源代谢情况Fig.4 Carbon metabolism of Proteus vulgaris under different pH values

2.3 NaCl浓度和pH对菌株不同类型碳源利用面积的影响

图7～图10为两株菌在不同NaCl和pH胁迫下对不同种类碳源利用面积的变化趋势比较,由图7～图10可知,在不同NaCl和pH胁迫条件下,两种腐败菌对糖类的利用能力最高,其次为羧酸类、氨基酸类和己糖磷酸类,其中糖类物质的利用受影响最大,说明糖类物质是维持两株菌生长的主要能源。两株菌能够利用的碳源相似,其中糖类物质主要包括:D-麦芽糖、D-海藻糖、龙胆二糖、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、L-果糖、L-鼠李糖、肌苷和D-甘露糖醇;氨基酸类包括D-丝氨酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-谷氨酸、L-组胺、L-丝氨酸;羧酸类包括P-羟基-苯乙酸、L乳酸、L-苹果酸和乙酸;己糖磷酸类包括D-半乳糖醛酸、D-葡糖酸和D-葡糖醛酸。

图7 NaCl浓度对普通变形杆菌不同种类碳源利用面积的影响Fig.7 Effect of NaCl concentration on utilization area of different carbon sources of Proteus vulgaris

图10 pH对蜂房哈弗尼菌不同种类碳源利用面积的影响Fig.10 Effect of pH values on utilization area of different carbon sources of Hafnia alvei

图7～图8可知,随着NaCl浓度的增加,普通变形杆菌的碳源利用面积呈下降趋势,1% NaCl浓度下与空白相比相差不大,NaCl浓度升高到2%时,各类碳源利用面积下降较多。以糖类、氨基酸类和羧酸类为例,由1% NaCl浓度下的1366.80±0.15、431.41±0.17和507.84±0.34分别下降到了826.33±0.22、258.92±0.25和333.22±0.37。pH的变化对两株菌的各类碳源利用面积影响不大,pH为7.0时,糖类、氨基酸类和羧酸类的利用面积分别为1399.39±0.81、453.13±0.25和528.40±0.44,pH为5.0时,糖类、氨基酸类和羧酸类的利用面积分别为1360.57±0.63、495.90±0.51和455.20±0.42。在相同pH下,普通变形杆菌不同碳源的利用面积稍小于蜂房哈弗尼菌。

图8 pH对普通变形杆菌不同种类碳源利用面积的影响Fig.8 Effect of pH values on utilization area of different carbon sources of Proteus vulgaris

图9～图10显示,蜂房哈弗尼菌的碳源利用面积变化受NaCl和pH的影响与普通变形杆菌相似,随着NaCl浓度的增加,各类碳源的利用面积逐步下降,糖类、氨基酸类和羧酸类在1%浓度下分别为1045.25±0.13、335.88±0.24和398.66±0.32,5%盐浓度下降至460.13±0.23、177.01±0.31和204.66±0.45。pH的变化同样对蜂房哈弗尼菌影响不明显,在pH5.0～7.0的范围内各组碳源利用面积相差不大。

图9 NaCl对蜂房哈弗尼菌不同种类碳源利用面积的影响Fig.9 Effect of NaCl concentration on utilization area of different carbon sources of Hafnia alvei

研究显示,碳源种类和浓度能够影响细菌生物被膜形成能力,当以蔗糖为碳源时,普通变形杆菌形成的生物被膜高于葡萄糖[26],以木糖为培养基时,蜂房哈弗尼菌的生物被膜形成量最大[27]。

2.4 不同NaCl浓度和pH下菌株碳源代谢主成分分析

主成分分析是能将BIOLOG产生的大量数据转化为少数综合指标的一种统计分析方法,用于分析不同处理下微生物碳源代谢差异,是BIOLOG数据分析的一种常用方法[28]。图11为培养第10 d的不同NaCl浓度和不同pH对两株菌碳源代谢的Biolog监测数据主成分分析载荷图,以71种碳源做主成分因子分析,两组变量KMO系数均大于0.8,Bartlett’s检验的p均小于0.001,数据结构合理,具有良好相关性。普通变形杆菌前两个主成分所构成的信息量为77.92%,主成分1贡献度为62.45%,主成分2贡献度为15.47%;蜂房哈弗尼菌前两个主成分所构成的信息量为80.36%,主成分1贡献度为68.11%,主成分2贡献度为12.25%。

由图11可见,不同条件下两株菌的碳源代谢在主成分二维体系中存在空间分布差异。不同pH的分布点较为集中,彼此距离相近,可见pH的变化对普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌碳源代谢影响无显著差异。而NaCl浓度对两株菌碳源代谢能力的影响则不同,对于普通变形杆菌,1%～3%NaCl浓度条件下分布点与pH的距离不大,而4%与5%浓度的NaCl浓度距离较远,向主成分1负轴和主成分2正轴偏移,说明高盐浓度显著影响了普通变形杆菌对不同类型碳源的代谢;对于蜂房哈弗尼菌,随着NaCl浓度的增加,分布点逐渐向主成分1负轴和主成分2正轴偏移,5%NaCl浓度距离最远,说明NaCl浓度对蜂房哈弗尼菌碳源代谢影响更显著。

图11 不同NaCl浓度及pH下两株菌碳源代谢主成分分析载荷图Fig.11 Principal component analysis(PCA) for Proteus vulgaris and Hafnia alvei under different concentration of NaCl and pH注:a:普通变形杆菌,b:蜂房哈弗尼菌;A1:1% NaCl, A2:2% NaCl,A3:3% NaCl,A4:4% NaCl,A5:5% NaCl; B1:pH5.0,B2:pH5.5,B3:pH6.0,B4:pH6.5,B5:pH7.0。

3 结论

通过BIOLOG技术对不同NaCl浓度和pH条件下普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌的碳源代谢能力进行研究,结果表明,两株菌能够利用的碳源相似,与pH相比,NaCl浓度对两株菌的碳源代谢影响更大。在1%～5% NaCl条件下,随着浓度升高,两株菌的生长逐渐受到抑制,其碳源利用种类和利用面积逐渐下降,其中糖类物质受影响最大,在5% NaCl浓度下两株菌的生长较慢,受到较大抑制。在pH5.0～7.0的范围内,两株菌受影响不大,随着pH降至5.0,菌株生长受到一定抑制,但仍能维持生长。主成分分析结果与上述结果相对应,pH对两株菌碳源代谢影响不显著,随着NaCl浓度的增高,分布点逐步发生偏移,差异显著。通过比较NaCl与pH对普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌碳源代谢的影响,可为优化产品配方及深入探究其代谢机理等提供支撑。