甘草汽爆处理对甘草酸转化及其产物提取的影响

隋文杰,周梦佳,高灏杰,吕晓玲

(天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室,天津科技大学食品营养 与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457)

甘草酸(Glycyrrhizic acid,GL)是从甘草属(GlycyrrhizaLinn.)植物中提取获得,由一分子糖苷配基与两分子葡萄糖醛酸构成的天然高倍甜味剂。高纯度甘草酸及其盐的甜度约为蔗糖200～30倍,表现出抗炎、抑菌、解毒等多种生理活性[1-2]。单葡萄糖醛酸甘草次酸(Glycyrrhetinic acid 3-O-mono-β-D-glucuronide,GAMG)是由甘草酸脱去一分子葡萄糖醛酸形成。与GL相比,GAMG甜度更高,约为蔗糖的941倍;且GAMG安全性优于GL,无致畸变作用,生物利用度高[1-2]。因此,GAMG被认为是一种集高甜性、安全性及天然性于一体的新型功能性高倍甜味剂。甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid,GA)是GL进一步脱掉两分子葡萄糖醛酸的产物,即其糖苷配基部分,其虽丧失了甜度,但因具有更高的抗癌等药用价值而受到国内外学者广泛关注[3]。

通过化学催化和生物转化等方法以GL为底物制备GAMG和GA,是甘草酸开发利用的重点和研究热点。其中,化学催化主要是采用高温酸化裂解的方法直接催化GL转化为GA,这种方法催化条件较为苛刻,主要包括:加酸浓度高,加热温度高,设备腐蚀大,且转化率非常低。目前关于GAMG和GA的转化制备普遍采用生物转化途径[4-6],其实质是通过β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-GUS)催化GL发生脱糖苷作用生成GAMG和GA。但由于转化过程中存在诸多菌种和技术等方面问题而限制了该类方法的规模化应用,主要包括:酶的来源受限,对化学键选择性不强,副产物多[4];基因修饰增加成本且操作复杂,成功率不高[5];离子液体等非水相酶体系可提高酶稳定性,但其合成过程繁琐复杂且成本高[6]。因此,有待于寻找一种绿色、高效的甘草酸高值转化利用途径,促进甘草酸及其转化产物提取利用。

汽爆技术作为一种新型绿色食品加工技术,凭借原料适用性强、短时高效、无污染和已实现工业放大等优势,近年来在食品领域的研究和应用上受到广泛关注[7-9]。它是将原料在一定压力和温度的饱和水蒸气下蒸煮一段时间后,骤然减压使原料结构变化和组分分离的过程。对药食纤维原料汽爆加工过程若干研究和应用表明:汽爆的物理爆破作用能够打破植物多尺度抗提取屏障结构,促进活性成分溶解扩散[10-11];汽爆的热化学作用促进植物结构组分和活性成分发生水解反应,对某些糖苷类活性成分具有脱糖苷作用,从而促进高活性苷元成分的有效利用[11-12]。

因此,本文引入汽爆技术处理甘草,促进其GL高值转化及其转化产物提取利用。采用不同汽爆强度处理甘草,表征其表观形貌结构、主要化学组分与官能团结构变化,测定汽爆对GL转化及其转化产物提取过程的影响,对甘草糖苷类功能性高倍甜味剂的高效制备、产品开发和功能强化提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)饮片 北京仟草中药饮片有限公司;甘草酸、18β-甘草次酸、单葡萄糖醛酸甘草次酸、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖 均为标准品,纯度≥98%,天津鼎国生物技术有限责任公司;乙腈标准品(≥98%) sigma公司;磷酸、乙醇等 (分析纯),国药集团化学试剂有限公司。

QBS-200B汽爆试验台(反应罐体积为5 L) 鹤壁正道生物能源有限公司;KQ-500DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;CR-400色差计 日本东京柯尼卡美能达;SPD-M20A超高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司;SU1510扫描电子显微镜 长沙科美分析仪器有限公司;Nicolet iS50傅立叶变换红外光谱仪 上海力晶科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 汽爆甘草制备 取500 g(干重)甘草饮片(直径1～2 cm、厚度2～3 mm、单个重量0.2～1 g的圆形薄片)按照料水比1∶1 (w/w)进行复水处理12 h,使其含水率达到50%,将复水后甘草置于汽爆罐内,通入饱和水蒸汽至一定压力,在该压力下维持一定时间后,迅速打开卸料阀放料,收集汽爆甘草,自然风干后保存待用[10]。表1列出了实验中所采用的不同汽爆条件及其对应汽爆强度(lgR0)，以研究汽爆程度对甘草酸转化及其产物提取的影响。

表1 甘草汽爆处理条件与汽爆强度Table 1 Experimental condition of steam explosion and the severity factor lgR0

式(1)

式中:t为维压时间,min;T为汽爆温度,℃。

1.2.2 汽爆甘草表观(形貎)和色差分析 将干燥甘草原料和经过汽爆后的甘草采用佳能(Canon)IXUS 285 HS数码照相机拍摄光学照片，分析汽爆前后甘草表观形貌变化。将干燥甘草原料和经过汽爆后的甘草粉碎过40目筛,用色差计测量样品粉末色差数据L*(黑白偏差量)、a*(红绿偏差量)和b*(黄蓝偏差量)值,ΔE为色差综合偏差量[13],计算公式如下:

式(2)

式中:R表示原料甘草,S表示汽爆甘草。

1.2.3 汽爆甘草微观结构表征 将甘草原料和经过汽爆后的甘草置于105 ℃烘箱中干燥6 h后,用刀片沿饮片径向切取楔形薄片作为待测样品,用金溅射镀膜后,使用扫描电子显微镜于真空、5.0 kV的加速电压环境下进行微观结构观察[11]。

1.2.4 汽爆甘草化学组分分析 按照美国可再生能源实验室(NREL)的标准分析方法[10],测定汽爆前后甘草中水溶物、醇溶物、纤维素(以葡萄糖计)、半纤维素(以木糖和阿拉伯糖计)、酸溶性木质素、酸不溶性木质素和灰分含量。糖浓度(葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)测定采用高效液相色谱法,外标法测定。色谱条件为:Aminex HPX-87H色谱柱(300×7.8 mm,9 μm,聚苯乙烯二乙烯苯树脂填装),流动相为0.005 mol/L H2SO4,流速0.6 mL/min,柱温65 ℃,进样体积20 μL,示差折光检测器。

1.2.5 汽爆甘草红外光谱表征 将干燥甘草样品研磨后进行红外吸收光谱分析[10]。使用溴化钾混合压片制片,扫描范围:4000～400 cm-1,分辨率1.5 cm-1,扫描40次进行光谱累加,环境气氛为空气。

1.2.6 甘草酸及其转化产物提取 精密称取未粉碎的汽爆甘草样品25 g,按液固比20∶1 (mL/g)加入70%乙醇500 mL,在室温下进行超声辅助提取(功率250 W,频率40 kHz)18 h,每隔0.5 h超声处理0.5 h,分别在0.25、0.5、1、2、4、6、8、11、14、18 h摇匀取样,用于测定GL及其转化产物含量。表达式如下：

GL、GAMG或GA质量分数(mg/g)=(GL、GAMG或GA提取质量)/甘草质量×100

式(3)

1.2.7 甘草酸及其转化产物含量测定 将GL、GAMG和GA标准品溶于70%乙醇溶液中,分别稀释配制成0.1616～0.808 mg/mL、0.006～0.3 mg/mL和0.0082～0.32 mg/mL范围的溶液,通过高效液相色谱利用外标法制作标准曲线。GL标准曲线为y=107x+52126(R2=0.9990),GAMG标准曲线为y=3×107x-7379(R2=0.9991),GA标准曲线为y=2×106x+7770(R2=0.9994)。色谱条件参考[14]调整为:ZORBAX SB-C18(4.6×250 mm,5 μm)色谱柱;流动相为0.1%磷酸水A-乙腈B,梯度洗脱(0～3 min,38%～50% B;3～10 min,50%～52% B;10～20 min,52%～85% B;20～30 min,85～90% B;30～35 min,90%～38% B;35～41 min,38% B);流速为1 mL/min;进样量20 μL,柱温30 ℃,紫外检测波长为254 nm。

GL转化率、GAMG生成率和GA生成率表达式如下:

式(4)

式(5)

式(6)

其中:CGL→GAMG为0.786[1],代表1 g GL全部转化生成GAMG量为0.786 g,CGL→GA为0.574[1],代表1 g GL完全生成GA量为0.574 g;[GL]R、[GAMG]R和[GA]R分别代表原料甘草中的GL、GAMG和GA含量(mg/g),[GL]S、[GAMG]S和[GA]S分别代表汽爆甘草中的GL、GAMG和GA含量(mg/g)。

理论GL含量为转化成GAMG和GA的GL理论含量与提取液中实际测得GL含量之和,即在不计转化的前提下汽爆后甘草GL的理论提取量,计算方式如下:

理论GL含量(mg/g)=[GL]S

式(7)

1.3 数据处理

所有实验均重复3次,OriginPro 2017软件统计分析数据,计算标准误差并制图;应用SPSS 24.0软件进行ANOVA方差分析,p<0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 汽爆甘草物性变化

2.1.1 表观形貌和颜色变化 图1显示不同汽爆强度处理下甘草的表观形貌和色度差异。如图所示,实验用甘草饮片呈圆薄片状,质坚实,表面纤维性,黄白色,略显粉性,形成层环明显,射线放射状,有裂隙[15]。汽爆后甘草致密结构被破坏,粒径随汽爆强度增强而降低。在较强汽爆条件下甘草结构被破裂成纤维束状并缠绕在一起,在较低汽爆条件下甘草韧皮部与木质部分离脱落明显。这主要是在汽爆瞬时爆破过程中,高温液态水闪蒸和蒸汽绝热膨胀所致的物理撕裂作用和物料间碰撞作用共同导致[10]。

图1 不同汽爆条件处理甘草饮片表观形貌Fig.1 Apparent morphology analysis of Glycyrrhiza uralensis Fisch. treated by steam explosion under various conditions

汽爆后甘草颜色发生显著变化,随汽爆强度增加,其色差综合偏差量ΔE值和红绿偏差量a*值(p<0.05)显著增加,黑白偏差量L*值(p<0.05)和黄蓝偏差量b*值(p<0.05)显著下降,表明汽爆后甘草饮片颜色由原料的浅黄白色逐渐加深变暗,向深棕色或红褐色转变,且随汽爆条件增强变化愈加明显。引起甘草颜色加深的原因可能是,糖类物质和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)在汽爆高温高压下,通过焦糖化等美拉德反应生成褐色大分子物质,这些糖类物质来源于甘草多糖及汽爆热化学作用降解半纤维素形成的可溶性还原糖[9,16]。此外,在汽爆过程热酸性气氛下,一部分半纤维素和纤维素会生成酸不溶性物质,即假木质素,以球状形式附着于纤维表面,也可能是造成颜色变化的原因之一[17]。

图2 不同汽爆条件处理甘草颜色分析Fig.2 Color analysis of Glycyrrhiza uralensis Fisch. treated by steam explosion under various conditions.注:图中不同字母表示同一指标间差异显著(p<0.05)。

2.1.2 微观结构 图3为甘草汽爆前后的扫描电子显微镜图。图3a所示为甘草原料次生木质部部分,包括导管、管胞和木薄壁细胞,并有狭长裂隙;其导管较多,口径细小,呈类圆形。图3b中薄壁细胞及周围致密组织结构上附着有淀粉粒和草酸钙晶体。汽爆后(图3d,3e,3f),甘草微观结构明显被破坏:孔隙和裂隙增多、变大,呈束纤维部分分离和剥落,且维管束杂乱排布;结构表面呈近似融化状态,可能是由淀粉或结构性多糖在热酸性环境下发生糊化、降解所致;整体无序性增强。上述微观变化是由甘草汽爆过程热化学反应与闪蒸爆破耦合作用的结果[18]。结合2.1.1对甘草汽爆前后宏观结构变化的分析,表明汽爆能够显著破坏甘草细胞和组织水平的多孔结构[10]。汽爆后甘草多尺度孔隙网络结构的形成将有利于甘草胞内活性成分的溶解与扩散。

图3 甘草原料和汽爆甘草(lgR0=4.63)扫描电子显微镜图Fig.3 SEM image of untreated and steam exploded Glycyrrhiza uralensis Fisch. at lgR0=4.63注:a、b、c为甘草原料;d、e、f为汽爆甘草;1:导管,2:管胞,3:狭长裂隙,4:薄壁细胞,5:淀粉粒,6:纤维束。

2.1.3 化学组分 表2列出了汽爆前后甘草主要组分的含量变化。由表2可知,甘草中半纤维素含量随汽爆强度增加呈显著降低趋势(p<0.05),这表明汽爆具有强烈的半纤维素脱除作用。一般认为,汽爆过程中半纤维素发生部分自水解作用转化成单糖和低聚物,高温条件下,半纤维素链上水解下来的乙酰基生成乙酸,又加剧了半纤维素糖苷键和木质素芳基醚键的水解,导致单糖进一步降解生成糠醛和5-羟甲基糠醛[9]。甘草中酸溶性木质素含量在汽爆后降低,但随着汽爆强度增强变化不明显,而酸不溶性木质素呈增加趋势,与原料相比最高增加1.59倍。许多学者将酸不溶性木质素含量的增加归因于木质素自身的缩合反应,通常是与碳水化合物降解产物进行缩合形成“假木质素”[17]。而甘草中纤维素由于其非结晶区在高温高压条件下易被破坏[19],所以其含量随汽爆强度增加而相对降低,最低下降了24.32%。

表2 汽爆前后甘草主要化学组分含量Table 2 Chemical compositions of Glycyrrhiza uralensis Fisch. before and after steam explosion

甘草原料中水溶性物质含量高,占干重质量分数的41.48%±1.05%,对比文献[20]可知,其主要为甘草多糖、氨基酸、有机酸和核苷等活性物质;醇溶性物质含量相对较少,占干重质量分数的5.43%±0.55%,主要为皂苷、黄酮和香豆素类物质。实验表明汽爆处理能够促进甘草水溶性与醇溶性物质的溶出;随汽爆强度的增加,水溶物含量呈先增加后降低趋势,在汽爆强度lgR0=3.41条件下与原料相比最高增加31.29%;醇溶物在汽爆强度最高时亦达到最大值,相对原料增加56.72%。二者的增加一方面是由于汽爆对甘草宏、微观组织结构的破坏,促进了其胞内活性物质的大量溶出;另一方面则是由于汽爆水热作用使甘草木质纤维结构降解,生成易溶于水或醇的糖类、酚类等小分子物质。而水溶物含量在较高汽爆强度下转为下降,则可能是由汽爆促进了连接半纤维素的乙酰基团水解,产生的乙酸又进一步催化分解半纤维素降解的可溶性糖,使其生成甲酸和糠醛等挥发性成分所致;或者是水溶性成分缩合成腐殖酸类大分子物质等多重复杂因素导致[10]。

2.1.4 红外光谱表征 进一步利用近红外光谱表征并分析汽爆甘草细胞壁组分官能团结构变化。由图4可知,1737 cm-1处峰为半纤维素的特征吸收峰,该峰随着汽爆强度增加而趋于消失,表明大量的半纤维素发生脱乙酰化作用,形成有机酸[9]。在酸性条件下,半纤维素的非晶态和低聚合度使其易受到破坏,形成了自体水解作用。1459 cm-1和1382 cm-1处的吸收峰是纤维素和木质素C-H弯曲振动特征吸收峰,其吸收值在汽爆后降低,表明汽爆能够破坏纤维素与木质素间连接作用[19]。1225 cm-1处是木质素愈创木基芳香核C-O特征峰,其吸收值在汽爆后降低,表明汽爆后木质素基团结构发生变化[10]。1149 cm-1和1111 cm-1处的峰来源于纤维素和半纤维的C-O反式伸缩振动,1050 cm-1处是纤维素和半纤维素上C-O-C伸缩振动中C-OH骨架振动特征峰。

图4 不同汽爆条件下甘草的红外光谱图Fig.4 FTIR spectra of Glycyrrhiza uralensis Fisch. treated by steam explosion under various conditions

这些峰的吸收值在汽爆后发生明显变化,表明汽爆破坏了甘草木质素和结构多糖之间起到重要连接作用的酯键,并且降低了愈创木基木质素单元和半纤维素的相对含量,这与2.1.3中化学组分测定结果和相关报道结论一致[10,21]。结果表明汽爆具有显著的破壁作用,能够破坏甘草细胞壁水平组成结构,从而强化其胞内活性成分的溶解与释放。

2.2 甘草汽爆过程甘草酸水热转化

表3为甘草原料与汽爆甘草提取液中GL、GAMG、GA含量及由此计算出的GL转化率和GAMG、GA生成率。由表可知,按照药典方法[15]提取测定甘草原料中GL含量为(34.85±1.30) mg/g,采用1.2.7中方法测定甘草原料中GAMG与GA含量,未检出。汽爆后,甘草提取液中均检出GAMG与GA,且随汽爆强度提高,GL含量降低,GL转化率在lgR0=4.63条件下最高达到24.23%±0.82%;GAMG和GA含量增多,二者生成率最高分别达到6.58%±0.18%和31.55%±0.74%;两种变化趋势导致GL及其转化产物之和先减小后增大。上述表明汽爆促使甘草中部分GL发生脱糖苷作用转化为GAMG和GA,且转化产物以GA为主;随汽爆条件剧烈程度增强,GAMG和GA转化效果愈强。进一步通过GAMG和GA生成率反推汽爆甘草中理论GL含量,发现汽爆后理论GL含量大于实测GL含量,且与甘草原料相比最高提高13.60%。其主要归因于汽爆处理协同促进GL转化及其溶解释放,这与汽爆甘草物性变化密切相关。

表3 不同汽爆条件下甘草中GL及其转化产物含量与GL转化率、GAMG和GA生成率Table 3 Extraction yield and conversion ratio of GL、GAMG and GA from Glycyrrhiza uralensis Fisch. treated by steam explosion under various conditions

GL是由酚羟基与糖缩合而成的β-D-葡萄糖苷,在汽爆过程的高压热酸性环境中,GL发生水解反应而使糖苷键裂解得到GAMG、GA和葡萄糖配基。其存在的水解途径主要分为:①:GL→GAMG;②:GL→GA;③:GL→GAMG→GA。其可能的水解机制则主要是通过攻击从水中解离出来的质子离子而发生[1]。汽爆高温蒸煮过程的热酸性环境主要来源于水分的pKw值随温度增加而降低产生的酸性水,以及甘草结构水解而释放出的乙酸等有机酸[9]。这种热酸性环境导致一系列自水解反应的发生,甘草中半纤维素发生部分自水解作用转化成单糖及其低聚物,木质素则降解成酚类低聚物。同时,甘草中GL糖苷键中的氧原子发生质子化,糖苷键断裂,形成糖基正离子形式或半椅形结构的中间体,然后通过键合羟基形成葡萄糖醛酸。主要水解反应过程大致可以分为三步进行:糖苷键中的氧原子被H+所攻击,导致其快速质子化;将正电荷转移到葡萄糖醛酸的C1位上,然后由于C-O键的断裂而形成碳正离子,并且将羟基提供给另一葡萄糖醛酸的C2位或五环三萜的C3位上;水输送OH-给碳正离子,形成葡糖醛酸残基,释放H+[1]。因此,GL糖苷键的水解本质是水热酸性条件催化水解,其关键是O-苷基的苷质子化程度。汽爆高温蒸煮过程使得GL在水热酸性条件下O-苷基受质子进攻使糖苷键迅速水解,从而加速释放出GAMG和GA。

2.3 甘草酸及其转化产物提取强化

图5为不同汽爆条件下甘草中GL、GAMG和GA的提取动力学曲线。由图5a可知,汽爆处理强化了甘草中GL的提取传质行为,且随汽爆条件增强,GL提取平衡时间缩短、提取效率增高。在较高汽爆强度下(lgR0≥3.41)GL在2 h左右达到提取平衡,而从原料中GL提取18 h后才接近平衡,故汽爆后甘草GL提取平衡时间缩短了80%以上。由图5b、5c可知,汽爆甘草中GAMG和GA均在提取进程2 h以内达到最大平衡量,且提取平衡时间随汽爆强度增大而呈缩短趋势。这表明汽爆处理显著促进了GL及其转化产物的溶解与释放。

图5 不同汽爆条件下甘草中GL、GAMG和GA的提取动力学曲线Fig.5 Extraction kinetics of GL,GAMG and GA from Glycyrrhiza uralensis Fisch. treated by steam explosion under various conditions.注:a:GL;b:GAMG;c:GA。

通过Bernardini的理论可以较好地解释GL及其转化产物的提取传质行为[11]:溶剂萃取包括溶解和扩散两个过程,溶解很快仅需数分钟,而扩散需要克服细胞壁和细胞膜的阻力,这个过程耗时较长。甘草原料细胞未破壁,而汽爆后甘草组织、细胞和细胞壁水平多尺度结构均遭到破坏,故前者的萃取过程以扩散为主,而后者以溶解为主。因此,汽爆后甘草中活性成分提取进程很快达到平衡,提取效率远高于未处理的甘草原料。由2.1中汽爆甘草物性表征结果与分析可知,汽爆高温蒸煮过程对甘草微观细胞壁组分的热化学降解作用,和瞬时爆破过程对甘草宏微观多孔结构的破解作用,均对甘草酸及其转化产物的提取传质过程有促进作用。作者相关研究表明,汽爆通过改变植物孔隙结构增加了GL及其转化产物在提取过程的溶剂-溶质可及性,改善其内部传质通路,是强化植物胞内活性成分提取传质的根本原因[10]。此外,已有许多文献报道证实了汽爆对植物中多糖类、皂苷类、黄酮类等多种胞内活性成分均具有强化提取传质的作用[10,12,22-23]。

3 结论

在汽爆过程热酸性环境下,甘草中GL自体水解发生去糖苷化作用,使其苷元与糖基分离而向GAMG和GA转化,GL转化率达到24.23%,GAMG和GA生成率分别为6.58%和31.55%。GL在高温高压酸性条件下,其糖苷键中O-苷基受质子进攻,而使糖苷键迅速水解释放糖分子,可能是甘草汽爆过程存在的糖苷键水解转化机理。同时,在汽爆过程水、热、力改性的协同作用下,甘草细胞壁主要组分被降解,其中半纤维素部分脱除、溶出,酸不溶性木质素含量增加。甘草组织-细胞-细胞壁水平多尺度孔隙结构被打破,表明汽爆成功破解甘草致密抗提取屏障结构。这导致汽爆后GL及其转化产物的提取平衡时间降低至原料的20%以内,显著增强提取效率。研究表明通过引入汽爆技术,有效促进甘草酸高值转化及其产物提取利用,对甘草糖苷类功能性高倍甜味剂的高效制备、产品开发和功能强化有积极意义。