浸润性乳腺癌组织人DOC2/DAB2相互作用蛋白的表达变化及其意义

易红，龙汉安，王舰梅，肖秀丽，叶入裴

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

目前，浸润性乳腺癌的治疗多采用手术、化疗、内分泌治疗、放疗及靶向治疗等综合治疗方式，但其病死率仍居高不下。DOC2/DAB2相互作用蛋白(DAB2IP)是Ras-鸟苷三磷酸酶活性蛋白(Ras-GAP) 家族的成员之一，该蛋白可参与调控细胞凋亡、血管生成、肿瘤的生长及转移，并与放疗耐受、化疗抵抗有密切关系[1,]。DAB2IP在尿路上皮癌、前列腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤的发生、发展中均发挥重要作用[2]。目前DAB2IP在浸润性乳腺癌组织中的表达及对患者化疗效果的影响研究较少。我们观察了浸润性乳腺癌组织、癌旁正常组织、发生癌转移的淋巴结组织DAB2IP的表达变化，分析DAB2IP表达与浸润性乳腺癌临床病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本院2017 年1 ～12月间诊治的浸润性乳腺癌患者124例，年龄32～74(49.7±11.2)岁；均行肿瘤切除术，术中病理诊断为浸润性乳腺癌，肿瘤直径0.9～12(5.0±2.5)cm；WHO分级为I级3例，Ⅱ级77例，III级18例(接受新辅助化疗病例不计入WHO分级)；淋巴结转移40例；接受术前新辅助化疗26例，治疗后病理反应评级Miller-Payne分级为1级+2级20例、3级+4级6例。术中保留患者浸润性乳腺癌组织、癌旁正常组织、发生癌转移的淋巴结组织标本，备检。本研究已取得患者及其家属同意，且经医院伦理委员会通过。

1.2 主要试剂 兔抗人多克隆抗体DAB2IP 购自美国Abcam公司，1∶300 稀释； 兔抗羊二抗、DAB 显色剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 浸润性乳腺癌、癌旁正常、发生癌转移的淋巴结组织DAB2IP检测 采用免疫组化EnVision 两步法。取浸润性乳腺癌组织、癌旁正常组织、发生癌转移的淋巴结组织标本，经10%中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，高压修复。加入非免疫山羊血清，室温孵育10 min。滴加一抗，4 ℃孵育过夜，滴加二抗，室温孵育30 min。 DAB显色，显微镜下控制，自来水冲洗终止显色。苏木素复染2 min，0.1%稀盐酸分化，饱和碳酸锂反蓝。脱水、透明、封片。以已知阳性标本为阳性对照。DAB2IP 蛋白表达阳性判断标准：以乳腺癌细胞质内出现棕黄色至深棕色颗粒为阳性细胞。阳性细胞必须符合以下标准：①细胞结构清晰；②阳性颗粒定位准确；③着色明显高于背景，对比清楚。按显色细胞数记分为阳性细胞数<1/3计1分， 阳性细胞数1 / 3～2/3计2分，阳性细胞数≥2/3计3分。按细胞显色深浅记分为无阳性反应细胞计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计算3分。二者乘积为最终结果，0 判为-，1～2 判为+，3～4判为++，6～9判为+++。至少随机观察5 ～ 10 个高倍镜视野(放大倍数为× 400)。-、+为低表达者，++、+++为高表达者。计算强阳性表达率，强阳性表达率=高表达例数/总例数×100%。

1.4 统计学方法 采用SPSS17．0 统计软件进行处理。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法；相关性采用Spearman 相关分析法。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

浸润性乳腺癌组织DAB2IP表达-、+、++、+++分别为56、23、18、27例，癌旁正常组织DAB2IP表达-、+、++、+++分别为8、16、32、68例，发生癌转移的淋巴结组织DAB2IP表达-、+、++、+++分别为23、10、5、2例。浸润性乳腺癌、癌旁正常、发生癌转移的淋巴结组织DAB2IP强阳性表达率分别为21.8 %(27 / 124)、54.8 %(68 / 124)、5.0 %(2 / 40)，两两比较，P均<0.05。

浸润性乳腺癌组织DAB2IP表达与浸润性乳腺癌临床病理参数的关系见表1。浸润性乳腺癌组织DAB2IP表达与浸润性乳腺癌患者年龄、脉管侵犯、神经侵犯、WHO分级均无关(P均>0.05)，与肿瘤大小(P=0.008)、淋巴结转移(P=0.03)、HER2(P=0.004)、ki67(P=0.013)、P53(P=0.014)有关。

26例接受新辅助化疗的患者中，浸润性乳腺癌组织DAB2IP高表达6例、低表达20例。Miller-Payne分级为1级+2级者中DAB2IP高表达2例、低表达18例，3级+4级者中DAB2IP高表达4例、低表达2例。相关性分析结果显示，浸润性乳腺癌组织DAB2IP表达与浸润性乳腺癌新辅助化疗治疗后Miller-Payne分级有关(P=0.013)。

3 讨论

DAB2IP是新发现的Ras GTP酶活性蛋白家族的成员。DAB2IP是肿瘤细胞生长，转移和癌症进展的抑制因子，涉及多种生物过程的调节，包括增殖、细胞凋亡、上皮—间质转化(EMT)、癌症干细胞(CSC)、自噬等等。该蛋白是多个信号通路的重要分子开关，参与细胞内信号调控。在膀胱癌中，下调DAB2IP激活PI3K / Akt和Ras / ERK信号通路增强膀胱癌T24和5637细胞增殖、迁移和侵袭能力[3]。DAB2IP可同时调节PI3K-AKT和ASK1通路，影响前列腺癌细胞的存活和凋亡[4]。在结直肠癌中，转录复合物EZH2 / HDAC1 / Snail通过抑制DAB2IP启动子转录活性及表达促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移[5]。DAB2IP还可抑制NF-κB诱导的EMT现象和肿瘤干细胞的功能，从而抑制结直肠癌进展[6]。多项研究[7,8]表明，DAB2IP还在肝癌、胆囊癌、卵巢癌、肾细胞癌等恶性肿瘤中表达下调。在前列腺癌中，DAB2IP表达受启动子甲基化和组蛋白修饰的抑制。在乳腺癌中，DAB2IP表达可因DAB2IP启动子区域的甲基化而降低，且DAB2IP表达降低与淋巴结转移相关，Ki-67表达升高与乳腺癌患者淋巴结转移情况呈正相关[9]。本研究结果显示，DAB2IP在乳腺癌中的表达高于癌旁组织及淋巴结转移灶，且与肿瘤大小、增殖指数Ki67及淋巴结转移显著相关，提示DAB2IP低表达与乳腺癌的生长、转移密切相关。

表1 浸润性乳腺癌组织DAB2IP表达与浸润性乳腺癌临床病理参数的关系(例)

Valentino等[10]发现，突变型P53通过结合并抑制细胞质中的肿瘤抑制因子DAB2IP促进胰岛素介导的PI3K/AKT1的活化，同时胰岛素可以与炎症协同作用以促进肿瘤细胞的增殖和转移。抑制基因p53突变是人Her2阳性乳腺癌中最普遍的遗传事件，突变型P53通过mutp53-HSF1-HER2正反馈环扩增HER2信号传导[15]。

乳腺癌治疗方法有多种，主要有手术切除、放射治疗、化疗、内分泌和分子靶向治疗等。其中，化疗方法包括术前化疗，即新辅助化疗(NCT)和术后化疗。因为癌细胞最终会产生化学抗性，因此了解癌症化疗抵抗机制至关重要。在DAB2IP敲低后，前列腺癌KD细胞表现出对几种化学治疗药物的抗性，增加DAB2IP可以恢复药物敏感性，特别是增强前列腺癌(PCa)细胞对微管稳定药物(紫杉醇，多西紫杉醇)和Plk1抑制剂(BI2536)的敏感性[12]。DAB2IP通过调节Wnt / β-catenin和IGF-I，抑制早期生长应答蛋白 1-分泌型簇集素(EGR1-sCLU) 基因的表达，而 EGR1-sCLU 基因的表达与化疗耐受性相关。当敲除DAB2IP后，可增加膀胱癌细胞的集落形成，降低PARP和caspase-3的表达，增加Bcl-2和Mcl-1的表达，从而减少癌细胞的凋亡，诱导化疗耐受[13]。另外，DAB2IP还通过与信号转导子与转录激活子3(STAT3)的相互作用影响肿瘤的化疗抗性。Wu等[14]发现，DAB2IP通过STAT3/Twist1/P-糖蛋白信号通路，调控非肌肉浸润性膀胱癌对吡柔比星的耐药及肿瘤复发。此外，DAB2IP可能与抑制Slug的转录或激活、ABCC1等耐药基因、CD133等干性基因的表达，来抑制胰腺癌的生长、转移和化疗抗性，从而抑制化疗药物吉西他滨的抗性，促进对新型化疗药物盐霉素对胰腺癌细胞的敏感性作用。在本研究中，我们也发现，低表达DAB2IP的组别，新辅助化疗后的Miller-Payne分级低，可能与DAB2IP缺失后引起的化疗抵抗相关。

综上所述，浸润性乳腺癌组织DAB2IP表达降低；此外，DAB2IP的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、HER2、ki67及P53的表达密切相关，提示DAB2IP可能通过HER2的扩增及过度表达、P53突变参与乳腺癌生长、转移。值得注意的是，DAB2IP缺失对化疗耐受的影响在新辅助化疗中得以体现，使得DAB2IP有望成为指导乳腺癌化疗及判断化疗效果的新指标，针对DAB2IP相关靶向治疗在乳腺癌的治疗方面具有有重要意义。