婴儿血管瘤组织中微小RNA-130a、B淋巴细胞瘤-2的表达观察

高培培，张兰成，朱光辉，卢彬，张数青

(天津市口腔医院，天津300041)

婴儿血管瘤(Infantile hemangioma，IH)是婴幼儿常见的良性肿瘤。流行病学研究[1]表明IH发病率4．5%～6．5%。在低出生体重儿和早产儿中IH更为常见[2]。IH的病因尚不明确，可能与组织缺氧、高血管生成活性等因素有关。目前临床将IH病情分为增殖期(早期快速增殖期、后期缓慢增殖期)和退化期。患儿出生后随生长发育多数IH能自然消退，不需要临床介入治疗。但伴发感染、溃疡、出血等病情复杂的IH需要进行治疗，位于声门位置的IH可危及患儿生命。近年来，血管瘤的治疗理念发生较大转变，即由消极等待观察转变为积极干预的观察，普萘洛尔、纳多洛尔和激光治疗等对IH具有明确疗效[3，4]。目前没有一种治疗手段可治愈所有IH患儿，同时临床尚缺乏评估IH病情进展的可靠指标。研究IH发生、发展中的具体分子机制是目前研究热点。非编码RNA可通过影响基因的转录、RNA的加工修饰、mRNA的稳定性及影响染色体结构的装配等，对细胞活动发挥重要的调节作用，进而调节机体免疫功能、炎症反应及肿瘤的发生发展等病理生理学过程。根据核苷酸的长度，非编码RNA又可分为小ncRNAs(<200 nt)和长ncRNAs(>200 nt)。微小RNA(micro RNAs, miRNA)是一类由18～25个核苷酸组成小型内源非编码RNA，miRNA异常表达能调节肿瘤发生发展、血管生成、浸润转移等生物学过程[5]。miR-130家族的miR-130a位于11q12上，能够促进血管内皮细胞的增殖、迁移等过程[6]。B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)家族包括20种促进和抑制凋亡的蛋白，Bcl-2蛋白是一种重要的抗凋亡蛋白。敲除Bcl-2的小鼠血管内皮损伤加重，促进血管病变的发生[7]。目前关于miR-130a、Bcl-2在IH组织中的表达相关报道较少。本研究选取我院2016年1月～2017年1月间收治的IH患儿临床病理资料，，观察IH组织中miR-130a、Bcl-2 mRNA及蛋白的表达变化，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择我院2016年1月～2017年1月间收治的IH患儿33例，其中男18例、女15例，年龄1～12月，中位年龄7个月。所有标本术后均经病理诊断为IH。33例患儿均为初次诊断及治疗，并排除其他恶性肿瘤，既往未接受激光、药物注射、手术等治疗。33例患儿均行手术切除IH，术中保留IH组织及瘤旁正常皮肤组织。33例份IH组织经HE染色后根据组织结构特点分期为增殖期(组织血管腔不明显或血管腔呈裂隙样，内皮细胞数目增多，细胞核较大且浓染)17例份、退化期(血管腔较多且大，内皮细胞数目较少，且染色较浅，超过20%部位有脂肪浸润或纤维变性)16例份。本研究经本院医学伦理委员会批准通过，患儿家属均知情同意并签字。

1．2 IH、瘤旁正常皮肤组织miRNA-130a及Bcl-2 mRNA检测 采用荧光实时定量PCR法。分别取20～30 mg的IH、瘤旁正常皮肤组织，在研钵中加入液氮反复研磨3次，1．5 mL的EP管中50 mg匀浆中加入1 mL的TRIzol摇匀，加200 μL氯仿混匀后室温孵育10 min，4 ℃下离心(12 000 rpm，10 min)后形成三层，取上层水样层。加入等体积异丙醇，离心后取上清液，75%酒精500 μL洗涤后离心弃上清，加入50 μL的DPEC溶解后，-70 ℃冰箱备用。以总RNA为模板，用PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒(购自Takara公司)进行反转录合成目的cDNA(反转录引物oligod(36)AGC)，实验步骤按照试剂盒说明书进行，-70 ℃保存。荧光实时定量PCR检测：上下游引物设计应用primer5．0软件设计。miRNA-130a内参选择U6基因，Bcl-2内参基因选择β-actin。引物均由ABI生物公司合成。miR-130a特异性引物正向序列：5′-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3′，反向引物序列：5′-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3′，内参基因U6上游序列:5′-CTCGCTTC-GGCAGCACA-3′，下游序列:3′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-5′，Bcl-2基因上游引物序列：5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′，下游引物序列：5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′，β-actin基因上游引物序列：5′-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3′，下游引物序列：5′-GGGCATACCCCTCGTAGATG-3′。按照1∶100体积稀释1 μL的cDNA，加入5 μL的SYBR Green PCR Master Mix、0．4 μL引物。反应条件为：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃20 s，共40个循环。均在荧光定量PCR仪上完成，每个样本重复3次。以2-ΔΔCt代表miRNA-130a及Bcl-2 mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1．3 IH、瘤旁正常皮肤组织Bcl-2 蛋白检测 采用SP免疫组化染色法。取IH、瘤旁正常皮肤组织标本，检测各组Bcl-2蛋白，免疫组化实验步骤：用切片机将石蜡包埋标本切片(厚度5 μm)，65 ℃烘箱2 h，常规二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡，梯度水化后高压锅内140 ℃、2 min抗原热修复，自然冷却，3% H2O2避光灭活内源性过氧化物酶2 min，PBS清洗三次后加入一抗(稀释比例1∶800)，4 ℃孵育过夜，PBS清洗三次后，加入二抗(稀释比例1∶500)，37 ℃孵育30 min，DAB显色5 min，苏木紫复染3 min，常规梯度脱水后，树脂封片照相。Bcl-2阳性为内皮细胞膜或胞质出现棕黄色颗粒，采用图像分析软件观察 IH、瘤旁正常皮肤组织Bcl-2蛋白，每张切片选取5个视野(×400)，测算每张切片的平均光密度、阳性面积率，阳性面积率为计数100个细胞中的阳性细胞数，结果取5个视野的平均值。

2 结果

2.1 IH、瘤旁正常皮肤组织miRNA-130a及Bcl-2 mRNA相对表达量比较 IH组织、瘤旁正常皮肤组织中miR-130a相对表达量分别为3.71±1.23、 0.87±0．21，退化期、增殖期IH组织miRNA-130a相对表达量分别为3.68±1．40 、3．72±1．63；IH组织及瘤旁正常皮肤组织Bcl-2 mRNA相对表达量分别为1.213±0.272 、0．614±0．22，退化期、增殖期IH组织Bcl-2 mRNA相对表达量比较分别为3.68±1．40 、3．72±1．63，与瘤旁正常皮肤组织比较，退化期、增殖期IH组织miRNA-130a及Bcl-2 mRNA相对表达量均升高(P均<0.05)。

2.2 退化期、增殖期IH组织及瘤旁正常皮肤组织Bcl-2 蛋白光密度值及阳性面积率比较 退化期、增殖期IH组织及瘤旁正常皮肤组织Bcl-2光密度值及阳性面积率见表1。与瘤旁正常皮肤组织比较，IH组织Bcl-2蛋白光密度值和阳性面积率均升高(P均<0.05)；与退化期IH组织、瘤旁正常皮肤组织比较，增殖期IH组织Bcl-2蛋白光密度值和阳性面积率均升高(P均<0.05)。

表1 退化期、增殖期IH组织及瘤旁正常皮肤组织Bcl-2光密度值及阳性面积率

2.3 IH组织中miRNA-130a与Bcl-2表达相关性 IH组织中miR-130a与Bcl-2 mRNA的表达呈正相关(r=0．451，P=0．008)。

3 讨论

IH是婴儿期最常见的脉管系统肿瘤[8]，女性、早产、低出生体重和多胎妊娠等因素均是发生IH的危险因素。IH多发生于机体浅表部位，少部分位于内脏、肌肉等较深部位，对于特殊部位的血管瘤，如面部、关节、咽喉等处，影响患儿外观及功能。 IH通常在出生时不存在，经历瘤细胞增殖阶段，退化阶段，并最终随时间延长自行消失。 常见的并发症包括破溃、出血、感染及瘢痕形成等，在更严重的情况下，也可导致视力丧失，气道受损，充血性心力衰竭和死亡。血管瘤传统的治疗方法较多，如手术、激光、局部注射硬化剂等，但仍有疤痕形成、皮肤色素沉着、血管瘤复发等问题。目前血管瘤的病因尚不明确，病理上表现为血管内皮细胞的过度增殖，合成与分泌功能活跃。近年来，普萘洛尔在治疗婴儿血管瘤中取得良好的疗效，具有起效快，不良反应少等优点[9]。

miRNA是一类小内源性非编码RNA调控分子，长度约18～25个核苷酸，其通过直接结合其靶基因的3′-非翻译区(UTR)中的靶位点，可以诱导mRNA降解或充当翻译阻遏物，影响基因表达，参与正常细胞的增殖、分化、凋亡等过程的调控，还参与心血管疾病、肿瘤、慢性炎症及自身免疫性疾病的病理生理学过程。miR-130家族最初是在调节猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的研究中发现，该家族成员包括miR-130a、miR-130b、miR-301a和miR-301b。miR-130在多数人类癌症中作为肿瘤促进性的miRNA，例如在膀胱癌中miR-130的上调表达通过促进FAK和Akt磷酸化，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[10]。研究[11]表明，miR-130a在多种人类恶性肿瘤中异常表达(上调或下调)，包括胃癌、前列腺癌、肝细胞癌及慢性粒细胞白血病等。在IH中观察到miR-130a水平升高，抑制miR-130a表达后血管瘤细胞增殖能力与血管形成能力下降[12，13]。本研究中，IH组织中的miRNA-130a相对表达量均显著高于临近正常皮肤组织中的表达，结果表明miRNA-130a可能与IH的发生发展的过程有关。目前miRNA-130a表达升高的机制尚不清楚，可能与抑癌基因的失活，导致miR-130a基因启动子过表达有关。miR-130a表达升高后通过结合靶基因的3′UTR区，影响靶基因及下游基因的mRNA的转录，发挥调节作用[12]。如其可抑制癌基因CRMP4基因的表达，促进肿瘤细胞增殖、浸润及转移[14]。此外，miRNA-130a可与抑癌基因PTEN相互结合，促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，促进肿瘤细胞的转移[15]。

血管瘤的发生与血管内皮细胞凋亡和抗凋亡系统平衡失调有关。Bcl-2家族是参与细胞凋亡的重要蛋白质，包括抗细胞凋亡的Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Boo等，以及促进细胞凋亡的Bax、Bak、Bok、Bid等成员。Bcl-2蛋白是一种重要的抗凋亡蛋白，主要借羧基端的疏水片段连于线粒体膜、胞膜上。BCL-2蛋白的α-螺旋结构域结合促凋亡的BCL-2家族成员的BH1，BH2和BH3结构域蛋白形成的疏水口袋，这种相互作用的平衡有助于细胞应激状态下细胞凋亡调节。此外，Bcl-2蛋白可通过影响凋亡过程中内源性途经中的线粒体释放细胞色素C，并影响内质网Ca2+的释放，影响Ca2+依赖核酸内切酶活性，发挥抗凋亡作用。本研究中，血管瘤组织中Bcl-2 mRNA及蛋白表达均显著高于临近正常皮肤组织中的表达。表明IH中Bcl-2在转录和翻译水平均显著增高，与以往报道[16]一致。其原因可能是Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用抑制正常的细胞凋亡过程，促进血管瘤内皮细胞增殖。此外，本研究结果表明，增殖期血管瘤组织的Bcl-2蛋白表达高于退化期。以往研究中亦表明增殖期血管瘤内皮细胞凋亡水平显著低于退化期的凋亡水平[17]。目前对Bcl-2蛋白表达调控进而调节凋亡的具体机制尚不清楚，可能与细胞内非编码RNA调控因子，如miRNA，长链非编码RNA等，通过影响BCL-2基因mRNA的表达有关。有学者在动脉粥样硬化研究中发现，miR-181a能抑制Bcl-2蛋白表达，进而促进血管内皮细胞凋亡[18]。本研究中，血管瘤组织中miR-130a mRNA与Bcl-2mRNA表达呈正相关，结果表明miR-130a有可能通过上调Bcl-2mRNA表达，进而发挥调节凋亡过程的作用。有学者研究发现血管内皮祖细胞中miR-130a也可通过上调Runx3表达从而间接影响Bcl-2mRNA表达，进而促进内皮祖细胞的增值，影响血管瘤的发生发展[19]。但其具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，IH组织中miR-130a、Bcl-2表达升高，miR-130a、Bcl-2可能通过影响血管内皮细胞增殖和凋亡过程，参与IH的发生发展。miR-130a、Bcl-2有可能成为新的IH治疗靶点和预后的标志物，但其具体作用机制有待大样本深入研究。