低钾胁迫下烤烟苗期叶片的差异蛋白及其生物信息学分析

朱崇文，戴林建，肖泽凡，钟军

湖南农业大学农学院烟草系，长沙市芙蓉区农大路1号 410128

钾是植物生长发育所必须的矿质营养元素，参与植物体内碳、氮代谢等多项生命活动[1]。烟草是典型的喜钾作物，钾也是烟草吸收最多的矿质元素，充足的钾含量是烟叶优质的前提之一[2]。并对提高烟叶的燃烧性，改善烟叶品质，减少焦油产生具有重要作用[3]。

蛋白质组学是以蛋白质组为对象，研究蛋白质的表达水平，翻译后修饰的种类，蛋白与蛋白的相互作用等，从整体水平研究蛋白质的组成和调控规律[4]。周利等利用双向电泳结合质谱技术，对无菌培养四周的烟苗进行低钾处理，分别在低钾处理12 h、24 h和48 h检测到9种蛋白上调、10种蛋白上调和12种蛋白下调。其差异蛋白以光合作用相关蛋白质和与应激响应相关的蛋白质为最多[5]。

label-free定量蛋白质组学技术可基于一级谱图母离子强度或肽段匹配的二级谱图数目为基础的蛋白定量分析方法[6]。理论上，label-free可用于任何样本的蛋白质定量分析，可对不同来源的同一样本的定量数据进行互相比较，且数据移植性高[4]，得到广泛应用。宋浩等通过label-free蛋白定量技术研究了烟草青枯病菌侵染烟草后，其蛋白质应答情况，在致病菌株和非致病菌株中分别鉴定出15个致病性菌株中特有和287个非致病性菌株中特有的蛋白。这些差异表达蛋白主要定位于细胞外或与糖代谢相关[7]。阮土娣等利用液相色谱串联质谱和label-free定量技术，研究里氏木霉中磷酸化蛋白在阻遏条件、诱导条件和中性条件下的表达差异，分别在诱导对比阻遏条件、诱导对比中性条件、阻遏对比中性条件中发现差异蛋白90、61和90个。这些差异蛋白可以分为锌指蛋白、ATP结合蛋白、具有N-乙酰化转移酶活性的蛋白以及具有氧化还原酶活性的蛋白[8]。

本研究以烤烟高钾品系为材料，通过控制营养液中钾浓度建立低钾模型，采用label-free蛋白质组学技术定量分析蛋白质表达情况。生物信息学方法分析鉴定与烟草叶片低钾相关的差异表达蛋白质，探究差异蛋白的定位、功能以及参与的通路途径等，为烟草品种选育与栽培调控提供基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

烤烟高钾品系HKDN-5为湖南农业大学戴林建[9]等自主培育。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计与样品采集

试验设计详见参考文献10。

待烟苗生长到5-6片叶时，选取长势正常的4-5株植株，取其叶片制成混合样，每组取3个重复样。同时用铝箔纸包装好，编号，装入布袋，迅速投入液氮罐中保存备用。

1.2.2 蛋白质制备及浓度测定

取适量冷冻保存的烟草鲜嫩叶片，采用苯酚法[11]提取烟叶蛋白质，并用Bradford[12]法进行蛋白质含量测定。

1.2.3 蛋白质酶解、nano-HPLC-MS/MS分析及其生物信息学数据分析

蛋白质酶解方法、HPLC-MS/MS分析方法及其生物信息学数据分析详见参考文献10。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE电泳结果

图1为两组叶片蛋白质的SDS-PAGE分离后考染图，两组的细胞总蛋白质分布均匀，均无极高丰度的蛋白质，符合色谱质谱检测对蛋白丰度的要求，两者也具有相似的蛋白条带。

图1 叶片蛋白质SDS-PAGE电泳图Fig.1 SDS-PAGE electrophorogram of leaf proteins

2.2 差异表达蛋白质鉴定及统计

经质谱检测和数据库查询，烤烟高钾品系HKDN-5低钾对比正常钾组的苗期叶片蛋白质Group为3511个，蛋白质ID为11419个。在其中选取差异倍数为1.5以上，且有显著性意义（P<0.05）的差异表达蛋白质数量进行统计，可知低钾胁迫下的差异表达蛋白总数有101个，其中下调的蛋白点有52个，上调的有49个（图2）。

图2 差异蛋白质火山图Fig.2 Volcano plot of differential proteins

由表1可知，上调蛋白主要集中在[1.5-2]差异倍数间，占上调蛋白总数的53.1%，下调蛋白同样主要集中在[1.5-2]差异倍数间，占下调蛋白总数的59.6%。总的来说，差异表达蛋白质主要集中在[1.5-4]差异倍数间，占总差异蛋白质的90.1%，差异倍数大于2的差异表达蛋白质为44个，占差异表达蛋白质总数的43.6%。

表1 差异蛋白质统计表Tab.1 Statistics table of differential proteins

2.3 生物信息学分析

2.3.1 差异表达蛋白质的GO注释

由GO注释（表2）可知，差异蛋白质主要定位在细胞组分、细胞器组分和膜结构中，占差异蛋白总数的91%；具有参与水解酶活性、离子结合和转移酶活性的差异蛋白质数量最多，占差异蛋白总数的84%；差异蛋白参与细胞代谢、有机物代谢、单组织代谢、单组织细胞过程和基本代谢过程的数量最多，占差异蛋白总数的70%。

表2 差异表达蛋白质GO注释表Tab.2 GO annotation table of differentially expressed proteins

2.3.2 差异表达蛋白质的KOG注释

如图3所示，该图表示低钾胁迫中具有不同功能的差异表达蛋白质的数量统计，功能蛋白可分为17种，分别为A、C、E、G、H、I、J、M、O、P、Q、R、S、T、U、V和Z等。差异表达蛋白质中数量最多的为G类相关蛋白，数量最少的为H、I、Q、T和V类蛋白（均只有一个）。其中上调蛋白数量最多的为G类蛋白，下调蛋白数量最多的为O类蛋白，具有H、I和V功能相关的只有上调蛋白，具有A、P、Q和T功能相关的只有下调蛋白。说明在低钾胁迫下，关于碳水化合物运输和代谢相关的蛋白（G类）的上调表达在烟叶正常生长发育过程中发挥着关键性作用。

图3 差异蛋白质KOG分类图Fig.3 KOG classification map of differential proteins

表3为具有KOG号且差异倍数≥2的差异蛋白质鉴定表，由表可以更清楚地了解到蛋白质的名称及其具有的KOG功能，以及差异蛋白酶在烟叶生长发育过程中可能发挥的作用。据表3可知，有13个蛋白（7个上调，6个下调）参与到G、E、P和I等代谢相关途径；有2个蛋白（均为下调）参与到A和J等遗传信息处理相关过程；有9个蛋白（6个上调，3个下调）参与到M和O等细胞和环境信息处理相关过程；有6个蛋白（均为上调）参与到R和S等其他过程。

2.3.3 差异表达蛋白质的KEGG pathway分析

根据差异表达蛋白质的KEGG pathway分析可知，差异表达蛋白质共参与51条通路途径。其中包括24条代谢通路，占总通路途径的47.1%；9条合成途径通路，占总通路途径的17.6%；3条降解途径，占总通路的5.9%。差异蛋白质参与具有显著性差异的途径主要有：抗坏血酸与醛酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、淀粉与蔗糖代谢、氨基糖与核苷酸糖代谢、甘油酯代谢、二羧酸代谢、谷胱甘肽代谢和氨基酸生物合成等相关通路。而这些通路途径基本都与物质代谢相关，说明与正常钾组相比，低钾胁迫下的差异蛋白主要参与物质代谢途径。

3 讨论

植物在高钾低钾不同处理下，产生的差异蛋白及其参与的生物学途径不尽相同。关于高钾处理下烤烟苗期叶片差异蛋白的表达，本课题组已有论文发表（见2019年河南农业科学第5期）；关于低钾胁迫下烤烟苗期根系差异蛋白的表达，课题组也已有论文发表（见2019年中国烟草科学第1期）；本文只讨论低钾胁迫下烤烟苗期叶片差异蛋白的表达及其参与的生物学途径。

3.1 与代谢相关的差异蛋白质

有研究表明烟草[5,13]、棉花[14]、苎麻[15]等植物在经过低钾处理后，产生的差异蛋白中与代谢过程相关的主要包括氨基酸氨基转移酶、ATP合成酶、已糖激酶、磷酸酶类等。

本试验鉴定中，同样发现己糖激酶和肌醇单磷酸酶等发生上调差异表达，紫色酸性磷酸酶和丝氨酸羟甲基转移酶等发生下调差异表达。此外，还发现β-半乳糖苷酶和铜转运体蛋白等下调较为明显。这两类蛋白的差异表达可能与钾处理时间或烤烟品系的特殊性相关。

己糖激酶在试验中上调明显，该酶为淀粉与蔗糖代谢途径中的关键酶，具有催化己糖磷酸化的作用，其催化反应构成植物和其它有机体代谢活动的重要调控步骤[16]。己糖激酶还参与植物的糖感受和糖信号转导过程[17]，同时该酶既可参与葡萄糖抑制光合作用和糖酵解相关基因的调控，还在光合组织中起调节光合作用、生长发育和衰老的调节酶的作用[18]。

研究表明，紫色酸性磷酸酶能够在低磷胁迫下帮助植物体将不能吸收的有机磷转换成无机磷，以缓解植物缺磷状况[19]，而在低钾中，该酶的下调表达，可能是因为在缺钾环境下，与钾离子吸收转运等方面关系不大的蛋白会下调表达，助于维持内环境稳定。丝氨酸羟甲基转移酶普遍存在于真核生物中，在高等植物的一碳代谢和光呼吸中起着非常重要的作用[20]。此外，该酶是植物体的光呼吸作用中关键酶之一，植物体中缺乏丝氨酸羟甲基转移酶，则会由于不能发生产氧的光合作用，而导致植物体生长被严重延迟[21]。低钾营养下，该酶的下调表达便是植物生长缓慢，植株矮小的原因之一。

β-半乳糖苷酶又名乳糖酶，是一种广泛存在于动植物及微生物中的多功能酶。它不但能够水解乳糖，还具有半乳糖苷转移活性[22]。研究表明β-半乳糖苷酶的功能团可能不利于植物体的生长发育，特别是叶片的生长，所以该酶发生下调表达。铜转运蛋白不仅参与铜的细胞摄取，而且在其它重金属离子的摄取过程中也发挥重要作用[23]。它是一种定位于细胞膜的跨膜转运蛋白，除了转运铜离子外，也可以转运其他金属离子，只是能不能转运钾离子还尚未可知，需要进一步研究。

3.2 与应激反应相关的差异蛋白质

低钾胁迫在分子水平上的响应，与其他非生物刺激的响应有相同之处，不同的逆境刺激响应在分子水平的转录调控中可能具有相同的调控方式和调控过程[24]。研究发现烟草[5,13]、棉花[14]、苎麻[15]等植物在低钾胁迫下的差异蛋白中与应激反应相关的主要包括超氧化物歧化酶、过氧化物还原酶、转录因子等。

在本研究鉴定中，主要为谷胱甘肽S-转移酶和膜联蛋白等酶发生上调表达，50S核糖体蛋白、蛋白酶体亚基和蛋氨酸亚砜还原酶等酶发生下调表达。鉴定的差异蛋白存在不同，同样可能与钾处理的时间不同或与烤烟高钾品系的特殊性相关，为烤烟高钾品系的差异蛋白质组学研究鉴定基础。

谷胱甘肽S-转移酶的上调表达可作为植物应对逆境压力的标志之一[25]，在植物初级和次级代谢、诱导胁迫和信号转导中具有重要功能[26]。该酶在代谢和解毒方面发挥重要作用[27]，表现在使内源性或外源性毒素失活从而发挥解毒的作用[28]。该酶也可以参与细胞内物质的运输和储存、细胞信号通路的调节[29]等途径，在植物抗逆境胁迫以及维持植物的新陈代谢等方面发挥着重要作用[30]。其上调表达可能与烟草为在缓解钾缺失造成的外界环境压力问题，介于该酶的作用，推测该酶可能与钾离子的运输、储存及钾吸收转运的信号传递等途径有关。

蛋氨酸亚砜还原酶是目前唯一确定的蛋白质蛋氨酸亚砜残基特征性还原酶，能够将蛋氨酸亚砜还原为蛋氨酸，起到调节蛋白质的功能、调控相关信号通路、修复氧化损伤蛋白、防止氧化应激等作用[31]。虽然这些蛋白与植物体内蛋白的生理方面息息相关，但是并没有直接参与植物体生长发育或应激反应过程。

3.3 其他差异蛋白质

除了与应激和代谢相关的差异蛋白中，试验鉴定的主要有几丁质酶、羟酰基谷胱甘肽水解酶和D-甘油酸3-激酶等发生差异表达，且均为发生上调。几丁质酶是广泛存在于微生物和植物体内的一类蛋白质，能水解真菌细胞壁中的几丁质，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力，是一类重要的病程相关蛋白[32]。该酶是植物重要的防卫因子，在植物生长发育、抗逆和防御反应中发挥重要作用[33]。羟酰基谷胱甘肽水解酶参与节间伸长，与激素调节相关，可以通过与其他相关酶的交互作用，协调作用促进茎的伸长[34]。该酶的上调表达，无疑是在低钾这种逆境下，促进植物体生长的方式之一。

在本试验鉴定的蛋白中，并没有发现与钾转运体或离子通道直接相关的蛋白，推测可能的原因有：烟叶苗期期间，此类蛋白的差异并不明显；此类蛋白主要作用在根系中；与烤烟高钾品系的特殊性相关。具体的原因有待进一步研究。

4 结论

本研究通过label-free定量蛋白质组学技术对低钾胁迫下烤烟苗期叶片差异表达蛋白分析鉴定，大部分差异表达蛋白定位在细胞组分、细胞器组分和膜结构中，具有水解酶活性、离子结合和转移酶活性等分子功能，参与细胞代谢、有机物代谢、单组织代谢、单组织细胞过程和基本代谢过程等生物过程。具有碳水化合物运输和代谢功能的差异表达蛋白数量最多，且主要参与物质代谢相关途径。大部分差异蛋白质发生上调表达，为烟叶的抗逆生长等方面提供一定的保障。