基于ITS2序列的金莲花种子DNA条形码鉴定研究*

王金灿，王春淼，赵 晴，冯丽肖，石林春，刘金欣、△

(1.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000；2.中国医学科学院/北京协和医学院药用植物研究所）

金莲花为毛茛科植物金莲花Trollius chinensisBunge.的干燥花，味苦、微寒，主治上呼吸道感染[1]。在我国金莲花有16种，分布于河北、山西等地，其中以河北省承德坝上所产的金莲花药材最佳[2]。金莲花的药用价值较高，但其野生资源不足，难以满足市场需求，需要大规模人工种植。而种子是中药材种植的源头，因此保障金莲花种子的真伪就显得尤其重要。由于金莲花种子的形态学特征不明显，无法使用传统的方法来判断金莲花种子的真伪。DNA条形码分子鉴定技术是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列，来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，这项技术几乎不受环境、被鉴定物形态等情况的影响，可以很好弥补传统鉴定方法的不足[3-5]。DNA条形码分子鉴定技术已经成功鉴定了桔梗[6]、黄芩[7]、知母[8]等中药材的种子，但对金莲花种子的鉴定尚未有研究。本研究以金莲花种子为研究对象，采用DNA条形码技术对金莲花种子的基原进行了鉴定，以期为鉴别金莲花种子的真伪提供依据。

1 仪器与材料

MM400型球磨仪（德国Retsch公司），1-14型离心机（德国Sigma公司），NanoDrop 2000c型超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司），天根植物DNA提取试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司），PCR Master Mix试剂（北京艾德莱生物科技有限公司)。

来自金莲花道地产区河北省承德市和内蒙古自治区的金莲花种子9份，见表1：

表1 金莲花种子样品信息

2 方法与结果

2.1 DNA提取，PCR扩增和测序 从收集到的9份不同产地的金莲花种子样品中，每份样品选取3粒籽粒饱满的种子，分别进行编号（共27个实验编号）并使用天根植物DNA提取试剂盒提取单粒种子的DNA，提取操作步骤参照试剂盒说明书进行，使用超微量分光光度计鉴定金莲花种子DNA的质量。参照《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》扩增ITS2序列，PCR产物经纯化后，使用测序仪进行双向测序，并参照《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》判断测序峰图质量。

结果显示27个实验样品的DNA浓度平均值为26.2g/μl，DNA的A260/A280位于1.8～2.0之间，A260/A230的平均值约为1.18，说明所提取的DNA纯度较高。采用琼脂糖凝胶电泳法和凝胶成像法检测PCR扩增产物，所得电泳见图1，在480bp的位置上有明显条带。双向测序所得测序峰图分离程度高，无重叠峰出现，可进行序列拼接获取ITS2序列。

图1 琼脂糖凝胶成像电泳图谱

2.2 序列比对、NJ系统发育树构建和BLAST分析 利用Muscle 3.8软件进行多序列比对，用中药材DNA条形码鉴定系统（http：//www.tcmbarcode.cn）进行BLAST鉴定分析，利用MEGA 7.0软件构建NJ系统发育树，使用BLAST法和NJ系统发育树法进行物种鉴定。

9份金莲花种子样品，每份样品选取3粒，共获得27条ITS2序列，相关序列已提交至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）。基于建立的金莲花ITS2条形码数据库，分别使用NJ系统发育树法和BLAST方法进行基原物种鉴定。由NJ系统发育树可知，所有样品分为两支，JLHZ03（Z31、Z32、Z33）和JLHZ04（Z41、Z42、Z43）单独聚为一支，与其它样品区分明确（图2）；经BLAST比对后可鉴定出JLHZ03和JLHZ04为播娘蒿，其余序列可鉴定为金莲花。

图2 金莲花种子样品NJ系统发育树

3 讨论

本研究结果显示除JLHZ03和JLHZ04两份样品为播娘蒿外，其余7份金莲花种子均为正品。金莲花可清热解毒，主治上呼吸道感染、扁桃体炎等疾病，其中以治疗上呼吸道感染最为有效，具有较高的医用价值[1]。然而，金莲花在自然状态下根的再生能力差，仅靠种子繁殖，但其种子常随着药用部位—花的被采摘使用而遗失，因此造成了种质资源的流失[9]，而金莲花的这种特点导致目前市场上金莲花种子的市售价格较高（平均900元/斤）。播娘蒿在除华南外全国各地均可生产，资源充足，因此其种子的市售价格远低于金莲花种子，且与金莲花种子外观形态相似，难以通过形态特征进行区分，部分商家为了追逐利益在金莲花种子中混入了播娘蒿种子。根据2015版《中国药典》[10]记载，播娘蒿以种子入药，药材名为葶苈子，葶苈子可以泻肺平喘、行水消肿，与金莲花的功效截然不同。在金莲花种子中混入播娘蒿种子不仅会给农户造成严重的经济损失，还会增加临床安全用药的风险。

然而，金莲花种子的形态学特征不明显，无明显的种脐等特征，传统的形态鉴定方法在鉴定金莲花种子上存在一定的局限性，因此亟需一种新的手段来鉴定金莲花种子。DNA条形码分子鉴定技术显著推动了分类学的发展[11-12]，同时中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则已经成功纳入2015年版《中国药典》[13]，中药材DNA条形码分子鉴定技术也已经深入到中药材生产的源头-中药材种子的鉴定研究[6]。本研究以市售金莲花种子为研究对象，基于ITS2序列对其基原进行鉴定，结果显示ITS2序列可以用于鉴定金莲花种子。因此，本研究可为在源头上保证金莲花物种子的真伪提供依据。