Ⅲ期-Ⅳ期预后不佳DN患者血清蛋白标志物分析*

刘垠浩，陈丽贞

（福建中医药大学附属漳州市中医院，福建漳州 363000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一种由糖尿病引发、以肾脏微小血管病变为主要表现的一种慢性疾病。DN时显微镜下可见肾小球硬化、基底膜增厚、系膜基质增多，临床上多表现为不同程度蛋白尿，可伴高血压和浮肿，肾功能将随着疾病发展逐渐恶化。目前，医学界仍未能完全阐明DN的具体发病机制，故难以找到有效的根治方法。尿微量白蛋白（urinary microalbumin，MALB）在很长一段时间里，被认为是诊断DN的无创伤性生物学标记物[1]，但众多研究发现其诊断的特异性及准确性并不理想。周红梅[2]对60例DN患者的MALB进行检测，结果显示阳性率仅为53.3%；朱晓英等[3]研究显示，MALB对早期DN检验的灵敏度为67.5%，特异度为89.6%。因此，迫切需要找到更有效的办法来诊断DN。

“蛋白质组学”的概念于上世纪90年代被首次提出[4]，它将基因所表达的蛋白质作为一个整体进行研究。随着科技的高速发展，目前该技术逐渐成熟，众多学者纷纷将其运用于DN领域的研究，试图寻找出诊断DN更加敏感及特异性的标志物[5-6]。本研究运用表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱技术（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI技术）检测了Ⅲ期-Ⅳ期DN患者及健康者血清，通过筛选组间差异蛋白，从蛋白质水平探讨了DN预后不佳的血清标志物。

1 资料与方法

1.1 入选标准 ⑴诊断标准：DN的诊断采用《中国糖尿病防治指南》中“糖尿病肾病的表现及分期”标准[7]。⑵纳入标准：符合诊断标准；年龄≥18岁或≤70岁；运动+饮食+西药降糖治疗1周后，空腹血糖≤7.8mmol/L和餐后2h血糖＜10mmol/L者，或糖化血红蛋白≤7.5%；肾小球滤过率60～130ml/min或24h尿蛋白定量≤3.5g；血压控制在＜180/110mmHg；接受并签署知情同意书。⑶排除标准：其它原因所致的尿蛋白增多者(如泌尿系感染、高血压、免疫疾患、心力衰竭等)；合并乙肝、结核等传染性疾病，肝功能异常者；糖尿病酮症酸中毒者；被医生判定不宜纳入研究者。

1.2 一般资料 2017年1月-2018年6月符合入选标准的50例住院Ⅲ期-Ⅳ期DN患者的血清标本，分为预后不佳组和预后良好组。预后不佳组满足以下≥3个条件[8-9]：尿白蛋白排泄率＞30mg/d，肾小球滤过率＜90ml/min，显微镜下见K2W结节，临床出现血压轻至中度升高，伴不同程度的水肿。

采集同期25例健康体检者血清标本作为对照组。三组在性别、年龄等方面比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1：

表1 三组受试者一般资料比较(±s )

表1 三组受试者一般资料比较(±s )

组别 n 男 女 年龄/岁 病程（年）预后不佳组 27 14 13 45.00±18.76 8.53±5.49预后良好组 23 11 12 38.60±14.87 6.28±3.11正常对照组 25 10 15 47.14±17.05 ——

1.3 标本、芯片的处理及数据的处理 将制备好的血清加入含适量裂解液的EP管中，4℃下静置30分钟后加入缓冲液，吹打血清样品；芯片每孔加入缓冲液震荡处理后每孔加入制备好的血清样品100μl，4℃震荡1小时、甩出样品；将200μl的结合缓冲液加入芯片，室温震荡5分钟，甩出液体，共操作2次；每孔加入200μl去离子水后甩出；将基质物质(SPA，芥子酸)同富集的蛋白液混合，而后将其加到蛋白芯片上风干，直至达到共结晶状态；最后使用SELDI-TOFMS质谱仪（美国Ciphergen Biosystems Inc公司）检测。

采用Ciphergen ProteinChip、Biomarker WizardTM和Biomarker PatternsTM Software等软件进行数据的收集和分析，最终由BPS软件处理后生成结果。

1.4 统计分析 采用SPSS 19.0软件进行数据的统计分析。各组检测数据用（±s）表示，组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DN预后不佳组与正常对照组比较 27例DN预后不佳组与25例正常对照组质荷比（M/Z）数据对比后显示，M/Z为2687.14、3125.76、5904.29、7928.55和11401.03的这5个蛋白质的荷比峰比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表2：

表2 DN预后不佳组与正常对照组质荷比数据比较（±s ）

M/Z(Da) DN预后不佳组（n=27） 正常对照组（n=25） P 2687.14 2.94±2.65 0.91±0.42 0.030 3125.76 5.24±3.06 0.87±1.11 0.042 5904.29 2.23±1.96 0.71±0.58 0.035 7928.55 3.71±2.06 1.38±1.19 0.040 11401.03 4.49±2.74 1.55±0.88 0.020

2.2 DN预后良好组与正常对照组比较 23例DN预后良好组与25例正常对照组M/Z数据对比后显示，M/Z为3729.41、7928.55的这2个蛋白质的荷比峰比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3：

表3 DN预后良好组与正常对照组质荷比数据比较（±s ）

表3 DN预后良好组与正常对照组质荷比数据比较（±s ）

M/Z(Da) DN预后良好组（n=23） 正常对照组（n=25） P 3729.41 3.77±2.42 0.87±1.16 0.040 7928.55 6.53±7.07 3.05±2.34 0.030

2.3 DN预后不佳组与预后良好组比较 27例DN预后不佳组与23例预后良好组M/Z数据对比后显示，M/Z为3125.76、4237.91、6678.24和13754.80的这4个蛋白质的荷比峰比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表4：

表4 DN预后不佳组与预后良好组质荷比数据比较（±s ）

表4 DN预后不佳组与预后良好组质荷比数据比较（±s ）

M/Z(Da) 预后不佳组（n=27） 预后良好组（n=23） P 3125.76 2.48±4.51 1.19±1.07 0.030 4237.91 3.01±2.54 1.42±0.63 0.020 6678.24 4.45±3.98 0.78±1.12 0.040 13754.80 1.31±0.92 0.57±0.34 0.035

图2 DN预后不佳组与预后良好组蛋白质指纹图谱

3 讨论

蛋白质是构成人体组织的重要成分，发生疾病时必然伴随着蛋白质的变化，因此，蛋白质的变化可能为阐明疾病的发生机制和疾病的治疗提供新途径。蛋白组学的研究方法通过整体层面观察蛋白质的特性、表达和相互作用，能全面实现对细胞、器官甚至生命体的研究[10]。众多疾病均可导致血液中的蛋白质发生变化，且血液标本采集方便，容易被患者接受，利用血液标本结合SELDI技术实现疾病的早期诊疗，已成为当今医学界的研究热点。

DN是导致终末期肾脏病的主要原因之一，蛋白尿、高血压是公认的影响DN预后的危险因素[11-12]，且肾小球滤过率及病理分型在一定层面上可预测DN病情的进展速度和预后。安玉等[8]研究显示，DN患者随着肾小球病变的加重，蛋白尿逐渐增加，肾小球滤过率逐渐下降；MISE等[9]对205例DN患者的研究显示，肾小球病变分级与肾脏预后有关，随着肾小球病变加重，肾脏预后逐渐变差。因此，本研究利用尿白蛋白排泄率、肾小球滤过率、肾脏病理分级、血压升高程度、是否浮肿等作为主要参考指标与判定入选病人的标准，再对入选病人进行分组，试图寻找Ⅲ期-Ⅳ期DN患者预后不佳的差异蛋白。本研究结果显示，DN预后良好组与正常对照组比较，存在2个呈现高表达状态的差异蛋白；DN预后良好组与预后不佳组比较，存在4个呈现高表达状态的差异蛋白；DN预后不佳组与正常对照组比较，存在5个呈现高表达状态的差异蛋白。在排除了“背景噪音”、仪器最佳分辨度等方面存在误差的影响后，M/Z为3125.76Da的蛋白在Ⅲ期-Ⅳ期DN预后不佳组呈现特异高表达，且明显高于正常对照组与预后良好组。

虽然蛋白组学技术为探索疾病的发生机制和诊疗方法提供了新的平台，但仍有不足之处。首先，国际上应尽快制定统一评价标准来规范样本的制备；其次，蛋白组学的检测技术在操作过程中易被核酸干扰，而且测定混合有机成分时较不准确[13]；第三，数据统计处理方式仍有提高空间；第四，蛋白质数据库目前规模有限，难以提供较为完整准确的数据查询。但是蛋白组学广阔的研究方向及应用前景，值得继续深入探索。