CD19+CD24highCD38high调节性B细胞及相关细胞因子在视神经脊髓炎谱系疾病患者外周血中的变化及意义

董 梅，史肖鹤，王 炜，李世平，侯慧清，吴冰洁

视神经脊髓炎谱系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)是中枢神经系统(Central nervous system，CNS)炎性免疫性疾病，反复发作，主要为视神经炎、长节段横贯性脊髓炎和颅内典型部位[1]，中国、日本等亚洲地区患病显著高于欧美等国家[2,3]。常导致失明、截瘫等，是我国青壮年致残的重要原因之一。因此，探索其发病机制，寻找潜在的治疗靶点尤为关键。

水通道蛋白4(Aquaporin 4,AQP4)抗体(AQP4-Ab)是NMOSD特异性抗体，在NMOSD发病机制中占据重要作用[4]。2015年修订诊断标准将NMOSD分为AQP4抗体阳性和阴性两类，AQP4抗体阴性 NMOSD可能包含其他异质性致病因素[5]。AQP4-Ab与血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)的星形胶质细胞足突成分 AQP4特异性结合，在补体参与下，导致严重的星形胶质细胞(astrocyte,AS)损害，使AQP4和其标志性成分胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)大量丢失，形成NMOSD根本性病理损害-星形胶质细胞病(Astrocytopathy)[6]。上述证据表明：B细胞是NMOSD发病机制中重要参与者。作为AS重要组成成分，血清GFAP含量变化可以间接反应脑组织损伤程度。

B细胞除产生特异性抗体外，还有多种“抗体非依赖性(Antibody Independent) ”功能，例如，新近发现部分B细胞亚群具有免疫调节作用，称为“调节性B细胞”(Regulatory B cell,Breg)，主要通过分泌IL-10、TGF-β发挥免疫抑制作用，大量研究表明Breg在NMOSD急性期起重要作用。

本研究主要测定AQP4-Ab阳性的急性期NMOSD患者及健康对照组人群外周血CD19+CD24highCD38highBreg数量，以及血清IL-10、TGF-β的mRNA含量水平，进一步探讨Breg在NMOSD急性期的数量变化及功能，以及与EDSS评分之间的关系；通过对外周血GFAP测定及EDSS评分，探讨GFAP是否与疾病残疾程度有关。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取2016年12月-2017年12月就诊于河北医科大学第二医院东院区神经内科的27例急性期NMOSD患者为实验组(急性期：患者出现新的神经系统症状体征，持续时间大于24 h不缓解，EDSS评分增加≥1分)，同期选取性别、年龄相似的20位健康志愿者作为对照组。所有患者均经由我科主治及以上资质的医师诊断，符合最新NMOSD指南制定的诊断标准。本实验研究征得患者或家属同意，所有患者均在治疗前抽取外周血。

1.2 标本采集 患者急性期入院后，抽取晨起空腹静脉血两管，各2 ml，分别置于柠檬酸钠管、EDTA管中，柠檬酸钠管内血于-80 ℃冰箱保存备用。EDTA管静脉血立即送血液科实验室进行CD19+CD24highCD38highBreg检测，柠檬酸钠管标本冷存于-80 ℃，用于检测IL-10、TGF-β、GFAP的mRNA水平。

1.3 研究方法

1.3.1 临床资料收集 记录所有研究对象的基本信息，包括：姓名、性别、年龄、病程、EDSS评分、AQP4抗体结果等。

1.3.2 应用SYBR GreenⅠReal-time PCR方法检测血液中IL-10、TGF-β及GFAP的 mRNA含量，实验操作按产品说明书进行。

1.3.2.1 Real Time PCR检测目的基因引物均在北京Invitrogen公司合成。

1.3.2.2 提取样本总RNA：采用Trizol法提取样本总RNA，使用NanoDrop®ND-2000分光光度计测定RNA浓度和纯度。

1.3.2.3 逆转录合成cDNA：采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser方法进行，步骤一，去除基因组DNA反应：于冰上配制反应混合液，5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μl，gDNA Eraser1.0 μl，Total RNA 1 μg，加RNase Free H2O至总体积10 μl，42 ℃孵育2 min。步骤二，反转录反应，上述反应液加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μl，RT Primer Mix 1.0 μl，5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μl，RNase Free H2O 4.0 μl，共20 μl，37 ℃孵育15 min，之后放入85 ℃ 5 s，cDNA保存至-20 ℃冰箱备用。

1.3.2.4 Real Time PCR样本检测 将所有cDNA样品分别配置RT-PCR反应体系。体系配置如下：2 × Master Mix 10 μl，10 μmol的PCR特异引物F 0.5 μl，10 μmol的PCR特异引物R 0.5 μl，加水至总体积为18 μl 5000 rpm短暂离心。将18 μl 混合液、2 μl cDNA依次加入96-PCR板对应的每个孔中，混匀，置于Real time PCR仪上进行PCR反应，95 ℃，30 s；40个PCR循环95 ℃，5 s；60 ℃，40 s(收集荧光)。建立PCR产物的熔解曲线，从60 ℃缓慢加热到99 ℃。将目的基因和内参分别进行Real time PCR反应，每个样本进行3个复孔检测。仪器自动汇总荧光值后进行分析。

1.3.3 血清CD19+CD24highCD38highBreg水平测定 患者EDTA管静脉血送至河北医科大学第二医院血液内科实验室采用流式细胞学方法测定血清CD19+CD24highCD38highBreg水平。

2 结 果

2.1 研究对象的一般资料 NMOSD患者共27例，女性20例，平均发病年龄44岁(19～62岁)，患者均符合NMOSD诊断标准，平均EDSS评分3.59分，NMO-IgG阳性率75%。对照组20例，均为女性，平均发病年龄，41岁(20～64岁)，两组性别、年龄无统计学差异。

2.2 NMOSD急性期患者与健康对照组CD19+CD24highCD38highBreg相比下降，差异有统计学意义(P<0.05)。Breg水平与EDSS评分不存在线性相关关系(见图1、图2)。

2.3 NMOSD急性期患者与健康对照组血清IL-10、TGF-β的mRNA水平相比下降，差异均有统计学意义(P<0.05)(见图3、图4)。

2.4 NMOSD急性期患者与健康对照组血清GFAP水平相比升高，差异有统计学意义(P<0.05)。GFAP与EDSS评分之间无线性相关关系(见图5、图6)。

图1 NMOSD急性期患者为实验组，健康者为对照组，两组血液中CD19+CD24highCD38highBreg数量比较实验组明显降低P<0.05

图2 血液中CD19+CD24highCD38highBregs数量与EDSS评分无相关关系

图3 NMOSD急性期患者为实验组，健康者为对照组,两组血液中IL-10 mRNA水平比较实验组明显降低P<0.05

图4 NMOSD急性期患者为实验组，健康者为对照组,两组血液中TGF-β mRNA水平比较实验组明显降低P<0.05

图5 NMOSD急性期患者为实验组，健康者为对照组，两组血液中GFAP mRNA水平比较实验组明显升高P<0.05

图6 血液中GFAP含量与EDSS评分无相关关系

3 讨 论

B细胞是NMOSD发病重要因素，B细胞一个重要特征是激活后产生抗体。 其活化后大量增殖并分化为效应B细胞亚群(浆细胞)和记忆B细胞亚群(Memory B cell,Bmem)，浆细胞能分泌特异性抗体，中和抗原执行免疫保护功能，也可因攻击具有免疫原性的自体组织导致自身免疫性疾病发生[7]。Bmem则在再次受刺激后， 直接增殖、分化为浆细胞，产生大量抗体。此外，B细胞还有多种“抗体非依赖性”功能，包括抗原呈递、分泌各种细胞因子和趋化因子等。新近发现部分B细胞亚群具有免疫调节作用。Mizoguchi等[8]首次将具有免疫抑制特性的B细胞亚群定义为“调节性B细胞”(Breg)。大量研究提示Breg参与了自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等众多疾病的发病过程，Breg可抑制炎症反应细胞如DC细胞、T细胞的免疫应答，同时可促进Treg细胞的抑制炎症反应作用，并诱导Treg活化[9]。

目前发现，CD19+CD24highCD38highB 细胞、CD19+CD24+CD27+B细胞和CD19+CD1d CD5+B细胞是人类Breg的3种表型[10]。主要通过分泌IL-10、TGF-β、IL-35发挥免疫抑制作用，其中IL-10被认为是鉴定Breg的特征性标志[11]。其中，CD19+CD24highCD38highBreg于2010年由英国伦敦大学学院Blair等[12]证实，随后研究证实该表型Breg在多种自身免疫相关性疾病的患者外周血中数量降低且功能受损，表现为抑制性细胞因子IL-10分泌减少，从而抑制Th1细胞因子和诱导Th2细胞因子的能力降低。NMOSD患者Breg不同表型及相关细胞因子表达情况及其作用机制尚不清楚。故我们研究了CD19+CD24highCD38highBreg在NMOSD急性期患者中的变化。

我们的研究发现在AQP4-Ab阳性的NMOSD急性期患者外周血中Breg数量较健康对照组显著下降，与之前国内外学者的报道相一致。研究证明Breg通过分泌IL-10、IL-35、TGF-β等炎症抑制细胞因子，实现负向免疫调控，保障免疫平衡。Breg可通过分泌IL-35、TGF-β诱导B细胞分泌IL-10；通过分泌TGF-β及膜表面的CD80/CD86、GITRL诱导调节性T细胞生成；通过分泌IL-10促进辅助性T细胞向Th2分化并且抑制其向Th1的分化[13]。Breg及其细胞因子可与T细胞、单核细胞等之间进行动态、多样的相互作用，在免疫调节发挥至关重要的作用[14]。

IL-10是重要的抗炎细胞因子，对免疫反应的调控主要是通过抑制过度炎症反应实现。IL-10可诱导Th0向Th2发育，诱导Th2细胞因子，并通过抑制Th1细胞因子进一步抑制Th1发育，影响Th1/Th2平衡，阻止抗原呈递。单核细胞及巨噬细胞产生促炎因子，抑制树突细胞分泌细胞因子如IL-6、IL-12，因IL-12水平下降可抑制EAE进程，故IL-10/IL-12平衡在EAE发病过程中起重要调节作用。IL-10通过下调促炎性细胞因子、共刺激分子的表达，从而效应T细胞激活减少，进而发挥负向调节作用[15]。TGF-β抑制可细胞毒性T淋巴细胞、Th1型和Th2型细胞分化，促进外周血树突状细胞、Th17-、Th9-和Tfh-细胞的产生，在维持自身耐受性，控制免疫应答方面发挥着关键作用[16]。有研究采用CD8+CD103+iTreg过继转移治疗典型狼疮综合征的慢性移植物抗宿主病，表明可降低自身抗体和蛋白尿水平，减少肾脏病理损害，提高存活率，提示可能与TGF-β和IL-10信号，直接抑制B细胞反应有关。TGF-β在Bregs发挥负向免疫调节作用中占有不可忽视的地位[17]。此外，Breg可能通过产生TGF-β增强Treg的扩增[18]。

我们的研究证实NMOSD患者急性期外周血中IL-10和TGF-β的含量较健康对照组明显降低，上述研究结果提示NMOSD患者外周血Breg不仅数量减低，在功能上也存在异常，急性期免疫活性增强，免疫平衡紊乱，大量炎症因子激活，而相应抑制功能下降，造成组织损伤，这可能是NMOSD发病机制的重要组成部分。

NMOSD急性期AQP4抗体通过受损的BBB与AS足突表面的AQP4特异性结合， AS受损，GFAP作为AS的重要组成部分，释放入细胞间隙，通过BBB进入外周血，研究表明NMOSD患者中CSF中的GFAP浓度显著高于血清，血清中GFAP含量变化的研究相对少见，也较对照组水平增加[19]。我们的研究表明NMOSD患者急性期外周血中GFAP水平较健康对照组显著升高，与既往研究结果相一致，反应AS损害，BBB破坏，脑组织内发生炎性损伤。但我们的研究并未发现血清GFAP水平与EDSS评分之间具有明确相关性，分析原因可能为，本组患者大部分为复发患者，EDSS评分为多次复发后累积残疾评分，而检测的血清GFAP仅为此次免疫损伤后AS破坏的反应，故GFAP不能作为生物学指标反应复发的NMOSD患者病情严重程度及预后。