藏药十五味云鹏散含汞制剂和无汞制剂对急性痛风性关节炎大鼠的影响*

红梅，李先加，刘有菊，普措多杰

(1.藏药新药开发国家重点实验室，青海省藏药新药开发重点实验室，青海省藏医药研究院，西宁 810016；2.青海大学藏医学院，西宁 810001)

痛风是由于嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄障碍引起血尿酸增高的代谢性疾病，急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis，AGA)是其最常见首发症状。主要表现为反复发作的关节红肿热痛，严重可导致关节功能障碍。AGA是痛风的典型表现形式[1]，受累关节出现红、肿、热、痛，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和前列素E2(prostaglandin E2, PGE2)等炎症因子增加，产生关节软骨的炎症损伤，诱导基质降解，导致疼痛、肿胀等，从而破坏关节，导致关节畸形及功能障碍[2-3]。研究表明，体内尿酸钠盐晶体作用于血小板、中性粒细胞、滑膜细胞、单核细胞，刺激这些细胞释放多种炎症递质，如Ca2+、PGE2等， 这些炎性细胞因子通过自分泌和旁分泌在痛风发病的过程中发挥重要作用[4]。很多经典藏药制剂对痛风有独特疗效，笔者在藏医理论的指导下，通过查阅藏医药文献，从众多藏医药古方中筛选出藏药十五味云鹏散(sPos Khyung bCo lNga)[5]，其方源《藏医治疗宝库》有近800年的临床用药历史，其方源《贡珠藏医纪要及其注释》中十五味云鹏散有2种方剂，一种无汞炮制品制剂由乳香、决明子、黄葵子、巴夏嘎、诃子、毛诃子、木香、余甘子、宽筋藤、渣驯膏、藏菖蒲、儿茶、安息香、生乌头、麝香等药材组成，另一种是含汞炮制品制剂，由乳香、决明子、黄葵子、巴夏嘎、毛诃子、余甘子、宽筋藤、渣驯膏、藏菖蒲、儿茶、安息香、生乌头、麝香、水银热制炮制品、西藏猫乳等药材组成[6]。藏文名布琼觉安。十五味云鹏丸是藏医治疗关节疼痛、肿胀、关节腔积水、皮疹、皮肤瘙痒诸证的古方，至今已有一千多年的历史。现有的资料只是该药治疗疾病的临床研究总结，实验研究尚少。笔者在本实验观察十五味云鹏散含汞或无汞制剂对AGA及相关炎症因子的影响变化，以期为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1药品及试剂 本实验中所用十五味云鹏散有含汞制剂和无汞制剂两种制剂。十五味云鹏散含汞制剂含水银炮制品40 mg·g-1生药，无汞制剂未添加水银炮制品，产品批号均为20150305，由青海大学藏医学院提供；秋水仙碱片，云南昊邦制药有限公司生产，批号：141120，规格：0.5 mg；尿酸钠，美国SIGMA-ALDRICH公司产品，批号：BCBF1330V；TNF-α、IL-1β、PGE2德国国际品牌联盟(INTERNATIONAL BRAND LEAGUE，IBL)试剂盒，购于上海郁溪生物科技有限公司。

1.2仪器 JD1060-2电子天平，感量：0.1 g，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；TDL-5离心机，上海安亭科学仪器厂；SpectraMaxI3多功能酶标仪，美国MD公司。

1.3动物 无特定病原体(SPF)级SD雄性大鼠70只，体质量130～150 g，5周龄，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养条件：温度18～22 ℃，相对湿度：45%～50%，自然光照，排气扇通风。

1.4尿酸钠溶液的制备 称取尿酸钠2500 mg，充分研磨，加0.9%氯化钠溶液100 mL，同时加温搅拌成25 mg·mL-1尿酸钠混悬液[7]。

1.5分组与给药 将健康SPF级SD雄性大鼠70只适应性喂养1周，称体质量，简单随机法分为空白对照组，模型对照组，秋水仙碱片组，十五味云鹏散含汞制剂大、小剂量组及无汞制剂大、小剂量组，每组10只。根据人与动物给药剂量换算方法，十五味云鹏散含汞制剂和无汞制剂大、小剂量组给药剂量分别为0.28，0.07 g·kg-1、秋水仙碱片组给药剂量0.6 mg·kg-1。将药物溶于纯净水，配制成相应浓度药液。空白对照组、模型对照组给予相应体积纯净水，造模同天开始灌胃给药，连续5 d。

1.6AGA大鼠模型的制备[8]大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，50 mg·kg-1。用记号笔在大鼠右后肢踝关节周围标记，局部乙醇消毒，大鼠右踝关节摆放成直角，充分暴露踝关节与胫腓骨之间间隙，以45°夹角穿向大鼠右后肢背侧正中踝关节与胫腓骨之间关节腔，将25 mg·mL-1尿酸钠溶液0.2 mL注入踝关节腔，以关节囊对侧鼓起为注入标准，即成大鼠AGA模型。 空白对照组以0.9%氯化钠溶液代替尿酸钠溶液。

1.7关节肿胀度的测量 造模前，造模后24，48，72 h分别在大鼠右后足踝关节上方1.0 cm 处用编号笔作一横线标记，无弹性软皮尺测量大鼠受试踝关节相同部位周径，测注射后不同时间踝关节周径，每次重复测量3次，取平均值。关节肿胀度=造模后关节周径-造模前关节周径[9]。

1.8血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量测定 造模第5天，末次给药后1 h处死大鼠，取腹主动脉血2 mL，3000 r·min-1离心10 min(r=10 cm)，分离血清，保存，备用。按ELISA试剂盒操作说明书，绘制标准曲线，测定血清细胞因子TNF-α、IL-1β、PGE2含量[9]。

2 结果

2.1大鼠足踝关节肿胀程度 造模后24～72 h，模型对照组踝关节肿胀度较空白对照组明显增加(P<0.01)。与模型对照组比较，造模后24～48 h，十五味云鹏散含汞制剂(大剂量组48 h除外)和无汞制剂各剂量组受试足踝关节肿胀度均明显降低(P<0.05)；造模72 h后明显降低，但差异无统计学意义，见表1。

2.2血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量 与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量明显升高(P<0.05)；与模型对照组比较，十五味云鹏散含汞制剂大、小剂量组大鼠血清IL-1β、PGE2显著降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，无汞制剂大剂量组血清PGE2显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 7组大鼠不同时间踝关节肿胀度测定结果

组别剂量/(g·kg-1)24 h48 h72 h空白对照组—-0.18±0.16-0.16±0.13-0.16±0.13模型对照组—0.88±0.35∗10.66±0.38∗10.42±0.42∗1秋水仙碱片组0.00060.52±0.24∗20.28±0.24∗20.22±0.23十五味云鹏散含汞制剂 小剂量组0.070.56±0.16∗20.31±0.17∗20.18±0.36 大剂量组0.280.55±0.21∗20.38±0.210.21±0.15十五味云鹏散无汞制剂 小剂量组0.070.57±0.19∗20.33±0.14∗20.19±0.14 大剂量组0.280.54±0.14∗20.28±0.17∗20.15±0.18

与空白对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05

表2 7组大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2含量测定结果

Tab.2DeterminationresultsoftheserumlevelsofTNF-α,IL-1βandPGE2insevengroupsofrats

组别剂量/(g·kg-1)IL-1βTNF-αPGE2空白对照组—6.38±1.3778.68±16.71104.78±17.63模型对照组—8.10±1.78∗198.19±20.78∗1138.62±40.77∗1秋水仙碱片组0.00066.70±0.38∗282.69±10.12∗298.09±23.89∗2十五味云鹏散含汞制剂 小剂量组0.076.72±0.90∗283.77±21.7196.71±24.07∗2 大剂量组0.286.64±0.37∗281.56±14.2292.08±15.99∗3十五味云鹏散无汞制剂 小剂量组0.078.20±2.2286.35±20.91120.81±48.97 大剂量组0.286.73±1.3685.59±10.9196.58±33.71∗2

与空白对照组比较，*1P<0.05；与模型对照组比较，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with blank control group，*1P<0.05，;compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

3 讨论

研究表明，炎症细胞招募与内皮细胞激活所引发的炎症因子IL-1β和 TNF-α 等释放和炎症反应，在AGA 疾病过程中起重要作用[10-11]，AGA发作的特征性表现为关节滑液内中性粒细胞募集反应[12]。尿酸钠晶体被单核吞噬细胞摄取后可诱导IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子及炎症趋化因子生成，导致单核吞噬细胞、中性粒细胞及其他炎症细胞聚集于炎症部位，触发炎症级联反应[13]。临床一般采用秋水仙碱、非甾体抗炎药或糖皮质激素治疗AGA， 但这些药物均无法避免变态反应、中毒、骨髓抑制、肝肾损害等不良反应。十五味云鹏散具有消炎止痛作用，用于关节红肿疼痛、发痒等症，临床治疗效果明确[14-15]。本实验结果表明，十五味云鹏散含汞制剂和无汞制剂均能显著降AGA模型大鼠踝关节肿胀度，该药理作用可能与本方中安息香、生乌头、儿茶、藏菖蒲、麝香的消炎、止痛、敛黄水作用有关[16]；曾煦欣等[17]研究发现，余甘子甲醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位为余甘子抗炎镇痛的有效部位，其中以甲醇与正丁醇部位作用最强，推断余甘子治疗AGA的主要机制是抑制炎性递质PGE2和TNF-α释放。本实验发现小、大剂量含汞制剂明显能降低AGA大鼠血清IL-1β、PGE2水平，并存在量效关系；本实验结果还表明，无汞制剂只有大剂量组PGE2水平显著降低。与模型对照组比较，对IL-1β、TNF-α细胞因子的影响无统计学意义；提示十五味云鹏散含汞制剂较无汞制剂能更明显抑制AGA模型大鼠血清IL-1β、PGE2水平，这可能因为含汞制剂中配用了特殊炮制的名贵药材汞炮制品，并且汞炮制品具有祛风、化毒、疗疮等显著效果[18]，起到了增强药效、快速降低或抑制炎症因子分泌作用，可缓解症状，从而有效治疗AGA。