阿卡斑病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立和比较试验

苗海生，李 乐，廖德芳，寇美玲，朱建波，肖 雷，孟锦昕，杨 恒，李华春

(云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明650224)

阿卡斑病(Akabane disease)又名赤羽病，是由阿卡斑病毒(Akabanne virus)引起的主要感染牛、羊及其它反刍动物的一种传染病，主要传播媒介为蚊子、库蠓等吸血昆虫，流行特点具有明显的季节性和区域性。阿卡斑病毒目前分为4 个基因型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，基因型Ⅰ又分为Ⅰa 和Ⅰb 两个基因亚型[1-3]，该病毒为嗜神经性病毒，感染动物一般不表现体温反应和临床病状，但怀孕动物易发生流产、早产、死胎、胎儿畸形、木乃伊胎、新生胎儿发生关节弯曲和积水性无脑综合征。

由于目前国内所有易感动物均不免疫阿卡斑病疫苗，因此血清学监测方法对于该病的诊断、流行病学调查和评估具有重要意义。国内常用的血清学检测方法包括：中和试验、琼脂扩散试验、补体结合试验、血凝抑制试验。中和试验对试验条件要求高，重复性误差大，不适合普通实验室；琼脂扩散试验、补体结合试验、血凝抑制试验敏感性差，易受其它病毒干扰，使得检测结果不够准确[4-5]。国外公司已经开发出了针对该病的准确、便捷的ELISA检测方法，例如法国ID VET 公司开发的阿卡斑病毒ELISA 抗体检测试剂盒，但在国内售价昂贵。为打破国外对该产品的垄断，提高检测结果的准确性，降低检测成本，本研究利用云南本地分离到的阿卡斑病毒，通过培养、纯化、免疫，制备包被抗原和特异性的多克隆竞争抗体，优化反应条件，建立了阿卡斑病毒竞争ELISA (cELISA)抗体检测方法，并进行了该方法的敏感性、特异性、重复性、与国外同类产品的符合性试验，为阿卡斑病毒抗体检测和流行病学调查提供方法。

1 材料与方法

1.1 病毒、血清、细胞及实验动物 阿卡斑病毒由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室分离、保存，经RT-PCR 和序列测定鉴定为阿卡斑病毒。阿卡斑病毒标准阳性血清由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室制备。85 份牛、羊血清样品、BHK-21 由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存。1 型蓝舌病病毒(BTV-1)、BTV-4、BTV-9、BTV-16、小反刍兽疫病毒 (PPRV)、中山病毒(CZDV)、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、羊痘病毒(CPV)和 O 型、A 型、Asia-1 型口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清均由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室提供；40 份牛、羊阿卡斑病毒阳性血清和60份阴性血清由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室在云南师宗县、江城县、芒市采集、检测验证；BEI、ISA206 由中牧集团保山生物药厂提供；1.5 kg～2.0 kg 的实验兔购自昆明医科大学实验动物医学部。

1.2 主要试剂 单组分TMB 底物购自BIO BASIC INC 公司；HRP 标记的羊抗兔 IgG (IgG-HRP)购自VMRD 公司(批号：LZ0823B50102)；PBSTM：0.01 M的 PBS 加入 0.05 %的 TWEEN-20 和 1 %的脱脂奶粉；封闭液：0.01 M PBS 加入10 %蔗糖、5 %BSA；终止液为1.25 M 硫酸溶液；阿卡斑病毒ELISA抗体检测试剂盒购自法国ID VET 公司(批号：AKAC-4P 1215 A62)。

1.3 阿卡斑病毒培养、纯化和兔抗血清的制备 将阿卡斑病毒接种长满单层的BHK-21 细胞，4 d～6 d出现90 %病变(CPE)时收获病毒，并用BHK-21 细胞对其进行病毒效价的测定(TCID50)[6]，TCID50≥104/50 μL 时为合格。将检测合格的病毒液以4 000 r/min离心30 min 去除细胞渣。2 mM BEI 灭活剂37 ℃灭活30 h 将灭活后的病毒盲传3 代，不出现CPE 即为灭活彻底。

将灭活后的适量病毒悬液置于含30 %～70 %的连续蔗糖密度梯度管最上层，35 000 r/min 离心4 h后置紫外分光光度计连续测量其OD265nm值，收集在约50 %～60 % 蔗糖密度处的蛋白峰，即获得纯化的病毒。采用BCA 蛋白定量方法定量病毒含量，操作方法按照说明书进行。将纯化的病毒经ISA206 佐剂乳化后，按照2 μg/ 只/ 次免疫兔子，共免疫4只，分别于首免后14 d 和28 d 各加强免疫一次，第3 次免疫后14 d 心脏采血分离血清，应用微量血清中和试验(SNT)测定其中和抗体效价[7]，当抗体效价≥64 时大量采血并分离血清。

1.4 cELISA 检测方法的建立

1.4.1 cELISA 检测方法的的优化 采用方阵滴定法，用包被液(0.05M 的碳酸盐缓冲液，pH9.6)将纯化并定量的病毒分别稀释为0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL，50 μL/孔包被 ELISA反应板，4 ℃放置16 h，PBST 洗涤3 次，每孔加入50 μL 的封闭液，室温静置2 h，吸水纸拍干后通风柜再吹干2 h；制备的兔抗阿卡斑病毒多克隆抗体用 PBSTM 分别作 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400 稀释后，50 μL/ 孔，37 ℃放置，反应时间分别设置为30 min、1 h、1.5 h、2 h；洗涤 3 次，羊抗兔HRP-IgG 用 PBSTM 分别作 1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000 稀释后，50 μL/ 孔，置 37 ℃，反应时间分别设置为15 min、30 min、45 min、60 min；洗涤5次，加入底物TMB，50 μL/ 孔，37 ℃避光放置10 min，每孔再加入50 μL 的终止液终止反应，测定OD450nm值，计算抑制率(PI)，PI=100 %×(阴性对照 OD450nm值－样品OD450nm值)/ 阴性对照 OD450nm值。依据阳性血清与阴性血清对照差异最大化、阴性对照与空白对照差异最小化、反应时间最短的原则，综合确定最优的各反应条件。

1.4.2 临界值的确定 采用优化后的cELISA 方法对60 份牛、羊阿卡斑病毒阴性血清进行检测，计算平均PI 值()和标准差(SD)，根据临界值(cut-off 值)=+3SD，确定cELISA 检测方法的cut-off 值。对40份中和抗体滴度范围在1∶16～1∶128 的已知牛、羊阿卡斑病毒阳性血清进行cELISA 检测，确定最小阳性血清PI 值。综合分析已知阴性血清和阳性血清的检测结果，确定试剂盒的临界值。

1.4.3 特异性试验 应用本研究建立的方法检测BTV-1、BTV-4、BTV-9、 BTV-16、PRRSV、CZDV、EHDV、CPV 和 O 型、A 型、Asia-1 型 FMDV 阳性血清，同时设立阿卡斑病毒阴、阳性血清作为对照，评估本研究建立的cELISA 方法的特异性。

1.4.4 敏感性试验 将阿卡斑病毒标准阳性血清用PBSTM 作 2 倍倍比稀释(1∶2～1∶516)，同时采用该检测方法和SNT 方法进行检测，评估本研究建立的cELISA 检测方法的敏感性。

1.4.5 重复性试验 随机抽取4 份牛血清和4 份山羊血清，应用同一批次包被的ELISA 板和检测试剂进行批内重复试验，试验设3 个重复，验证批内可重复性；抽取3 批次包被的ELISA 板和检测试剂，分别对上述8 份血清样品进行检测，试验设3 个重复，验证批间可重复性。评估本研究建立的cELISA检测方法的重复性。

1.5 与国外同类试剂盒的比较试验 应用本研究建立的阿卡斑病毒cELISA 抗体检测方法与法国ID VET 公司的阿卡斑病毒ELISA 抗体检测试剂盒对85 份牛、羊血清样品同时进行检测，比较二者检测结果，计算二者的符合率。

2 结 果

2.1 病毒培养、纯化和兔抗血清的制备 阿卡斑病毒接种BHK-21 细胞，待90 %细胞出现CPE 后收获病毒后测定病毒TCID50。经计算收获的病毒TCID50为104.25/50 μL，达到该研究应用要求。将其灭活后经BHK-21 细胞盲传3 代，未出现CPE，即为病毒灭活彻底。将灭活后的病毒应用连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化后，经BCA 蛋白定量方法测定抗原含量为38.6 μg/mL，-80 ℃保存备用。采用ISA206佐剂乳化纯化的病毒并免疫兔子，3 次免疫后采血，血清经SNT 检测中和抗体效价为1∶64，达到应用标准，加0.01 % 硫柳汞，分装后-80 ℃保存备用。

2.2 cELISA 反应条件的优化 采用方阵滴定法确定各反应条件优化结果见表1。

2.3 临界值的确定 对60 份已知阿卡斑病毒抗体阴性血清样品和40 份已知阿卡斑病毒阳性血清进行cELISA 检测。结果显示，阴性样品平均PI 值(X)为 19.03 %，标准差 S=0.1，按照 cot-off 值 =PI+3S计算该值为49.03 %。40 份已知阳性血清样品PI 值均大于60 % (表2、图1)，考虑到未知病毒可能会出现的交叉反应，因此将临界值设定为60 %。按照该判定标准，40 份已知阳性血清采用该cELISA 方法检测均为阳性。

表2 阿卡斑病毒抗体阴性和阳性血清样品检测结果统计Table 2 Statistics analysis of positive and negative serum samples of antibodies against Akabane virus

2.4 特异性试验结果 采用本研究建立的阿卡斑病毒 cELISA 抗体检测方法检测 BTV-1、BTV-4、BTV-9、BTV-16、PPRV、CZDV、EHDV、CPV 和O 型、A 型、Asia-1 型FMDV 阳性血清，同时设立阿卡斑病毒阴、阳性血清作为对照。结果显示，除了阿卡斑病毒阳性血清检测结果为阳性外(PI≥60%)，其余检测结果均为阴性(PI＜40 %) (表3)，表明该检测方法的特异性较强。

图1 阿卡斑病毒抗体阴性和阳性血清样品的正态分布图Fig.1 The normal distribution of negative and positive serum samples of akabane virus

表3 cELISA 特异性试验结果Table 3 The specific test of the cELISA

2.5 敏感性试验结果 将阿卡斑病毒标准阳性血清2 倍倍比稀释后，分别采用本研究建立的cELISA 方法和SNT 方法进行检测。结果显示，本研究建立的方法在阳性血清样品稀释至128 倍时检测结果仍然为阳性(表4)，SNT 检测阳性血清样品的最低稀释度为1∶64。表明该检测方法的敏感性为1∶128，敏感性高于SNT。

表4 cELISA 敏感性试验结果Table 4 The sensitivity test of the cELISA

2.6 重复性试验结果 采用本研究建立的cELISA方法对8 份血清样品进行重复性试验，批内重复性试验结果显示，8 份样品的SD 为0.12～1.01，变异系数(CV)为0.54 %～5.27 %。批间重复性试验结果显示，8 份样品 SD 为 0.3～1.24，CV 为 0.3 %～9.3 %，均小于10 % (表5)。表明该检测方法具有良好的重复性。

表5 cELISA 重复性试验结果(n=8)Table 5 Repeatability assay of the cELISA (n=8)

2.7 与国外同类检测方法比较试验结果 采用本研究建立的阿卡斑病毒cELISA 抗体检测方法与法国ID VET 公司的阿卡斑病毒抗体检测试剂盒同时对85 份牛、羊血清样品检测。结果显示，本研究建立的cELISA 方法共检出阳性样品53 份，阴性样品32份，IDVET 试剂盒共检出阳性样品54 份，阴性样品31 份，经计算二者符合率为91.76 %。在7 份检测结果不一致的样品中，分别有3 份和4 份样品经本研究建立的cELISA 检测结果分别为阳性和阴性；而经ID VET 阿卡斑病毒抗体检测试剂盒检测结果正好相反(表6)。分析认为这可能与两种方法使用的病毒株不同有关，表明本研究建立的阿卡斑病毒cELISA 抗体检测方法达到可以替代国外同类产品的要求。

表6 本研究建立的检测方法与国外同类试剂盒比对试验结果Table 6 The comparison of the cELISA established in this study with the commercial detection kit

3 讨 论

阿卡斑病毒目前主要在澳大利亚、东南亚、东亚、中东和非洲地区流行[7-8]，由该病毒引起的并发症是导致畜禽业重大经济损失的原因之一，日本和韩国等国家虽然通过接种疫苗降低了发病率，但仍然经常有病例发生[9-10]。我国也是阿卡斑病毒的主要流行地区之一，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室2013 年～2017 年监测结果显示，该病毒主要在我国广西、云南等南方热带亚热带地区流行，北方部分省份也从牛、羊血液里检出了特异性抗体和病毒核酸。由于目前国内易感动物不接种阿卡斑疫苗，田间动物无疫苗接种抗体的干扰，血清学抗体监测对于流行病学调查具有重要意义，因此建立优良的ELISA 检测方法非常重要。国外进口的阿卡斑病毒ELISA 抗体检测试剂盒价格昂贵，急需实现同类产品的国产化。

本研究建立的阿卡斑病毒cELISA 抗体检测方法所选用的病毒为云南省主要流行株，使用纯化的全病毒颗粒制备包被抗原和制备多克隆抗体，同时由于我国及东亚地区流行的病毒株同源性较近[11]，因此该方法对我国及东亚地区的阿卡斑病毒抗体应当具有较广谱的检出效果。特异性试验结果显示，在该方法中包被的抗原与BTV、PPRV、CZDV、EHDV、CPV、FMDV 等牛羊易感病毒抗体无交叉反应，最大限度的保证检测结果的准确性，但由于缺少标准阳性血清，该检测方法对于其它病毒，特别是对于布尼病毒属的其它病毒，特异性尚不清楚；该检测方法与法国ID VET 公司的同类试剂盒比较结果显示，二者符合率达91.76 %，但仍有7份血清样品检测结果不一致，并且个别样品抑制率差距较大，由于未进行重复比较，初步判断这可能与两种方法使用的病毒株不同有关，还需要相关的试验进一步验证。

由于受到各种因素影响，包括阿卡斑病毒在内的家畜虫媒病毒病在国内并未引起足够的重视，国产成熟的抗体检测方法缺乏，随着国家对虫媒病毒病的不断重视和集约化养殖的扩大以后将对阿卡斑等虫媒病净化要求不断提升，该检测方法具有一定的应用前景。