海洋沉积物中邻苯二甲酸酯类环境激素的测定及其生态风险评估

胡红美，李铁军，张露，郝青，孙秀梅，金衍健，应忠真，郭远明

（浙江省海洋水产研究所，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江 舟山 316021）

邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters,PAEs）作为一类重要的环境激素，广泛分布在大气、水体、土壤、底泥、食品、动植物体及人体等各种介质中，具有类雌激素效应，可干扰人体和动物体的内分泌系统，导致生殖、发育和行为异常[1-2]。PAEs主要作为增塑剂应用于食品包装材料、纺织品、儿童玩具等产品中，也可作为农药、化妆品、润滑剂等化工产品的生产原料，已被世界多个国家列入“优先污染物名单”。

PAEs在环境中性质稳定，可持久存在。据报道，我国自然水体中邻苯二甲酸二丁酯（di-n-butyl phthalate,DBP）、邻苯二甲酸二-2-乙基己酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]含量整体高于国外，很多河流和湖泊中PAEs含量均高于我国《地表水环境质量标准》（GB 3838—2002）（DBP≤3 μg/L、DEHP≤8 μg/L）[3]。由于具有较强的疏水性，水体中的PAEs通常易于分布到沉积相中。邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate,DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate,DEP）、邻苯二甲酸丁苄酯（butyl benzyl phthalate,BBP）、DBP、DEHP为我国河流及湖泊沉积物中主要的PAEs污染物[4-5]，其中，DEHP含量通常最大，在我国使用最广泛，其吸附力强且难以被降解[6-7]，因此DEHP含量通常用来作为沉积物中PAEs污染的标志物[7]。总体上，我国沉积物中DEHP污染水平与国外相当。海洋沉积物是PAEs在环境中迁移和转化的重要载体、归宿地和集聚区，因此，研究海洋沉积物中PAEs的污染状况及其生态风险显得尤为重要。

现今，对海洋沉积物中PAEs最常用的检测技术主要有气相色谱-氢火焰离子化检测法、气相色谱-质谱法、气相色谱串联质谱法、高效液相色谱法等，而样品前处理通常采用索氏提取（Soxhlet’s extraction,SE）[8-10]、振荡萃取[11-12]、微波辅助提取（microwave-assisted extraction,MAE）[13]、QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged,safe）[14]、加速溶剂萃取（accelerated solvent extraction,ASE）[15-16]、超声波萃取（ultrasonic extraction,USE）[17-21]、基质固相分散萃取[22]等技术，结合层析柱净化[8,10-11,17,20]、固相萃取（solid phase extraction,SPE）[9,11,15,18-19,21-23]、浓硫酸净化[17]、分散式固相萃取（dispersive solid phase extraction,DSPE）[13]、分散液液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME）[24]等1种或2种净化方法。但在这些方法中，采用层析柱或固相萃取小柱法，虽净化效果较好，但操作复杂，需进行萃取柱活化、上样、淋洗、洗脱等过程，耗时较长，不适合批量样品处理；采用浓硫酸净化法回收率较低；分散液液微萃取法主要适用于简单液体基质样品，对于复杂固体基质需要将其转化为液体基质，且易产生基质效应。

近年来，DSPE法在罐头、鸡肉、海产品等食品检测过程中的样品前处理净化方面具有显著的优势[23,25-27]。而对于基质较为复杂的海洋沉积物，要想PAEs萃取完全，且排除杂质干扰，选择合适的萃取及净化技术是关键。基于本课题组前期将DSPE法应用于海产品净化方面的工作[23]，本研究进一步建立了一种适合海洋沉积物中PAEs检测的分散固相萃取净化方法，并将建立的方法应用于台州三门湾海域、温州南麂岛海域沉积物样品检测，同时对其生态风险进行评估，以期为PAEs海洋地球化学研究、环境污染控制和风险管理提供技术手段和科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

7890B/5977A气相色谱质谱仪（安捷伦科技公司，美国），冷冻干燥机（Labconco公司，美国），KQ-500B超声波萃取仪、MS3D型涡旋振荡器（IKA集团，德国），5810高速离心机（Eppendorf公司，德国），R-215旋转蒸发仪（Büchi公司，瑞士）。

所有固相吸附剂均购自上海安谱科学仪器有限公司，分别为石墨化炭黑吸附剂[graphitized carbon black（GCB），粒径120～400目]，N-丙基乙二胺吸附剂[primary secondary amine（PSA），粒径40～63 μm]，弗罗里硅土吸附剂（florisil，粒径60～100目），硅胶吸附剂（Si，粒径40～46 μm），C18吸附剂（粒径40～63 μm）。

16种PAEs标准品（表1）均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。以正己烷为溶剂配置成1 000 mg/L的混合标准储备液，再通过正己烷逐级稀释，配制成1 000 μg/L混合标准溶液，4℃保存。乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮等有机溶剂均为色谱纯。

表1 16种PAEs的保留时间、定量离子和定性离子Table 1 Retention time,quantitative ions and qualitative ions of 16 PAEs

1.2 色谱和质谱工作条件

1）色谱条件。HP-35MS毛细管气相色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度260 ℃，不分流进样，进样量1 μL；色谱柱初始温度100℃，按10℃/min升温至290℃（保持5.0 min）；载气为高纯氦气，流量1.0 mL/min；传输线温度260℃。

2）质谱条件。电子轰击型（EI）离子源，电离能量70 eV，离子源温度230℃；四级杆温度150℃；溶剂延迟3 min；SIM模式监测；特征离子见表1。混合标准溶液总离子流色谱图如图1所示。

各峰号对应的化合物见表1。Please see the Table 1 for the corresponding compound of each peak No.

1.3 样品采集和前处理

1.3.1 样品采集

分别用锚式采泥器采集台州三门湾海域、温州南麂岛海域的沉积物样品，样品贮存条件和预处理过程根据本实验室报道的方法[28]。用洁净的铝箔将采集的样品包装并密封于聚乙烯袋中，然后用便携式冷藏箱运回实验室。将待测样品置于冻干机中干燥24 h后，研磨，过100目不锈钢筛，置于干燥器内，待测。

1.3.2 样品前处理

称取2.00 g待测样品，置于50 mL玻璃离心管中，加入V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）＝1∶1溶液15 mL，涡旋1 min，超声提取15 min，根据需要加入铜粉1～3 g用于超声除硫，以3 000 r/min离心2 min，萃取液过无水硫酸钠柱，再向样品中加入V（正己烷）∶V（二氯甲烷）＝1∶1溶液15 mL，重复上述步骤，合并萃取液，38℃旋转蒸发至干，加入2 mL正己烷溶解，转移至含200 mg GCB的具塞玻璃离心管中，涡旋60 s，以3 000 r/min离心1 min，取上清液至另一玻璃离心管中，再依次加入2 mL丙酮、2 mL二氯甲烷、2 mL甲醇，重复上述涡旋、离心步骤，并合并上清液，氮吹至干，用正己烷定容至1 mL，进行气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）分析。

1.4 生态风险评估

1.4.1 质量基准法评价

目前，针对沉积物中的PAEs，由于国际上尚无统一的环境质量标准，我国也尚未制定相关标准，因此，本文采用环境风险限值（environmental risk limits,ERLs）进行海洋沉积物中PAEs生态风险评估。VAN WEZEL等[29]通过体内外毒性实验，建议DBP、DEHP的ERLs分别为0.7和1.0 μg/g，若测定的环境浓度（CME）＜ERLs时，则认为不存在PAEs内分泌干扰效应和生态毒性风险。对于其他种类PAEs，使用美国华盛顿州设立的警戒限值，各化合物均为 0.610 μg/g[30]。

1.4.2 商值法评价

商值法主要针对选定的生态受体进行化合物的风险商值（risk quotient,QR）计算，公式为：QR＝CME/CPNE。式中：CME为测定的环境浓度，CPNE为预测无影响浓度。当QR＜0.1，为低风险；0.1≤QR＜1，为中等风险；QR≥1，为高风险[31]。沉积物中污染物的正辛醇/水分配系数lgKow影响风险判定：对于3＜lgKow＜5的物质，QR与1比较；而lgKow＞5的物质，QR与10比较。这是由于lgKow＞5的物质易被沉积物所吸附，对生物的危害性下降，其评价标准可适当放宽。而当物质的lgKow＜3时，则不易被沉积物吸附，此时风险可忽略[32]。沉积物中PAEs的CPNE数据可通过美国国家环境保护局数据库中PAEs对相应敏感生物的毒性数据计算得到，结果见表2。

2 结果与讨论

2.1 萃取剂的选择

对不同萃取剂的萃取效果比较（图2）表明：用二氯甲烷重复萃取2次时，DMP、DMEP、DEEP的回收率较低（64%～68%）；选用V（正己烷）∶V（二氯甲烷）＝1∶1萃取时，DMP回收率略低（70%），DMEP、DEEP、DBEP则相对较高（92%～114%）；选用V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）＝1∶1萃取时，DMP、DEP、DIBP、DBP、DCHP、DNOP的回收率均相对较高（89%～118%）；联合选用V（正己烷）∶V（二氯甲烷）＝1∶1和V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）＝1∶1萃取时，所有PAEs回收率为86%～115%，整体萃取效果最好，为本实验优选。

表2 海洋沉积物中PAEs的预测无影响浓度Table 2 Predicted no-effect concentration(CPNE)of PAEs in marine sediments

图2 不同萃取剂对PAEs的萃取效果比较Fig.2 Comparison of extract efficiency for PAEs by different extractants

2.2 固相吸附剂及分散剂的选择

由于PAEs不耐酸碱，所以大多数文献采用层析柱或商品化SPE小柱净化。此外，采用浓硫酸净化、分散式固相萃取、分散液液微萃取也有少量报道。张渝等[13]采用微波辅助萃取、C18吸附剂分散固相萃取净化和GC-MS法测定土壤中的邻苯二甲酸酯的结果表明，该方法前处理需要在土样中加入弗罗里硅土，基质效应明显，且吸附剂仅分散在丙酮溶液中；进一步研究发现，丙酮中C18对DMP、DEP的吸附性较强。由于邻苯二甲酸酯种类众多，性质差异较大，因此，寻找一种合适的分散固相吸附剂，且不会带来基质效应，同时选择合适的分散剂以保证所有待分析的邻苯二甲酸酯的回收率，是突破现有方法瓶颈的关键所在。

本研究分别考察了200 mg PSA、C18、GCB、Si、弗罗里硅土等吸附剂的除杂效果。结果（图3和图4）表明：经过GCB吸附，分散液基本呈无色透明，除色效果最好，所有PAEs的回收率相对较高（78.5%～115%）。而其他吸附剂或多或少对PAEs略有吸附，如：PSA 对 DMP、DPhP、DNP有所吸附 ；C18对DMP、DMEP、DEEP、DBEP 有所吸附，且对干扰DNPP检测的杂质不起作用；Si对DNP有所吸附；弗罗里硅土对DMEP、DEEP有所吸附。因此，本实验选择200 mg GCB作为DSPE吸附剂。

图3 不同吸附剂对PAEs的净化效果比较Fig.3 Comparison of purifying effect for PAEs by different adsorbents

图4 不同固相吸附剂净化时PAEs的总离子流色谱图Fig.4 Total ion current chromatograms of PAEs purified by different adsorbents

结合已有文献，采用DSPE净化土壤[13]或生物样[33]中PAEs时，使用1种分散剂的回收率较差，而本课题组前期通过DSPE净化海产品中PAEs时，使用GCB吸附剂结合多种分散剂，达到了满意效果[23]。因此，针对本研究中的沉积物，选用2 mL正己烷、2 mL丙酮、2 mL二氯甲烷、2 mL甲醇作为分散剂。

2.3 标准曲线和检出限

配制质量浓度为1～1 000 μg/L的混合标准系列溶液，按设定的仪器工作条件测定，结果（表3）表明，16种PAEs的线性关系良好，相关系数均大于0.999，以3倍信噪比计算的各化合物的检出限为0.10～0.25 μg/kg。

2.4 方法的精密度和回收试验

在温州南麂岛海域采集的沉积物样品中分别添加3个质量浓度水平的混合标准溶液，平行测定5次，加标回收率为75%～116%，相对标准偏差为3.1%～7.2%，结果的准确度和精密度满足分析方法要求（表4）。

表3 16种PAEs的线性回归方程、相关系数和检出限Table 3 Linear regression equation,correlation coefficient and detection limit of 16 PAEs

表4 精密度和回收试验结果Table 4 Results of test for precision and recovery

2.5 样品分析及生态风险评估

按照试验方法分别测定台州三门湾海域、温州南麂岛海域采集的沉积物样品，结果（表5）表明：在所有样品中，DMP、DEP、DIBP、DBP、DEHP均有检出，质量分数为1.32～277.98 μg/kg，占PAEs总量的98.7%～100%；此外，在部分样品中也有DNP被检出；16 种 PAEs的总量为 297.43～550.25 μg/kg。在不同采样点采集的海洋沉积物中PAEs组分特征如图5所示，在台州三门湾海域、温州南麂岛海域采集的海洋沉积物中DIBP、DBP、DEHP所占比例均最高，分别占PAEs总量的88.7%～92.7%和94.1%～96.7%。

表5 样品分析结果Table 5 Analysis results of the samples μg/kg

图5 不同采样点采集的海洋沉积物中PAEs组分特征Fig.5 Composition of PAEs in marine sediments collected at different sampling points

根据质量基准法评价，各采样点沉积物中的PAEs含量（CME值）均小于相应的环境风险限值（ERLs），其中台州三门湾海域CME/ERLs范围为0～0.28，温州南麂岛海域CME/ERLs范围为0～0.27，因此，生态风险较低。

根据商值法评价，在海洋沉积物中各PAEs对藻类、甲壳类和鱼类的风险商值见表6。由于DIBP和DBP的lgKow值分别为4.11和4.45，因此其QR值与1进行比较；DEHP的lgKow为7.50＞5，因此其QR值与10进行比较；DMP和DEP的lgKow值分别为1.61和2.38，均小于3，因此其对水生生物的风险可忽略。由表6可知，在台州三门湾海域海洋沉积物中5种PAEs对水生生物的风险商值为2.1×10－7～3.57，温州南麂岛海域为1.8×10－7～2.87。DEHP的QR值均远小于0.1，说明DEHP对水生生物为低风险；DIBP对台州三门湾海域甲壳类的QR值为0.54～1.13，均值为0.74，对温州南麂岛海域为0.39～0.52，均值为0.44，为中等风险；DBP对台州三门湾海域藻类的QR值为2.45～3.57，均值为3.19，对温州南麂岛海域为1.60～2.87，均值为2.16，呈高风险；DBP对甲壳类和鱼类均为中等风险。总体上，在海洋沉积物中PAEs对藻类、甲壳类、鱼类的风险大小顺序为DBP＞DIBP＞DEHP。

表6 海洋沉积物中5种PAEs的风险商值（QR）Table 6 Risk quotient(QR)of five PAEs in marine sediments

图6 不同采样点采集的海洋沉积物中5种PAEs对不同水生生物∑QR的影响Fig.6 ∑QRfor different aquatic organisms in five PAEs of marine sediments collected at different sampling points

在不同采样点采集的海洋沉积物中5种PAEs对藻类、甲壳类、鱼类的∑QR见图6。台州三门湾海域5种PAEs对水生生物的∑QR范围为1.06～3.87，温州南麂岛海域为0.51～3.02；在各采样点沉积物样品中PAEs对藻类的风险最大，其次为甲壳类，对鱼类的风险最小。总体上，台州三门湾海域PAEs对水生生物的风险略高于温州南麂岛海域。

3 结论

本研究采用超声波萃取法提取海洋沉积物中的PAEs，提取液浓缩后经200 mg GCB分散固相萃取净化后，进行GC-MS分析和萃取剂、固相吸附剂、分散剂选择优化，并进行了方法准确度、精密度考察。结果表明，所测样品中PAEs总量为297.43～550.25 μg/kg，组成上以DIBP、DBP、DEHP为主，占PAEs总量的88.7%～96.7%；经生态风险评估表明，当采用质量基准法评价时，各采样点沉积物中PAEs含量均小于相应的环境风险限值，生态风险较低；采用风险商值法评价表明，PAEs对藻类的风险最大，其次为甲壳类，对鱼类的风险最小。总体上，台州三门湾海域PAEs对水生生物的风险略高于温州南麂岛海域。