浙江省淳安县中华蜜蜂蜂房球菌聚合酶链式反应检测方法的建立与应用

郭蕊，董捷，郭海坤，李君竹，王德前*

（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州 310021；2.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州 310021；3.浙江省淳安千岛湖好清蜜蜜蜂专业合作社，杭州 311701）

淳安县隶属于浙江省杭州市，属山地丘陵区，蜜源丰富，以野桂花、枇杷花、山茶花、油菜花为主。随着精准扶贫工作的开展，淳安县政府对当地的中华蜜蜂（又称为“中蜂”）饲养业十分重视并大力推广。目前，该地区的中蜂养殖量大幅度增加，但与此同时，各种蜜蜂传染性疾病相继爆发，对中蜂的健康和蜂产品的安全生产造成严重威胁[1]，因此，做好病害流行病学调查，因地制宜采取有效防治措施显得尤为重要。然而，中蜂最易感染的细菌传染病——欧洲幼虫腐臭病在淳安县中蜂中的流行情况尚不明确。

欧洲幼虫腐臭病（European foulbrood,EFB），简称“欧幼病”，是发生于蜜蜂幼虫和蛹中的一种恶性细菌性消化道疾病[2]，在世界范围内均有发生。欧幼病的病原主要为蜂房球菌（Melissococcus pluton）。中蜂一旦感染蜂房球菌，其传播迅速，发病快，且迁延不愈。据报道，中蜂较意蜂更易感染，发病程度比西方蜜蜂更为严重[3]。世界动物卫生组织将欧幼病列为法定报告动物疫病[4]。研究表明，感染了蜂房球菌的蜜蜂幼虫化蛹后，病原仍可在蜂群内继续存活若干年，常常于春秋繁殖季节复发；在生产中主要采取防治结合、以防为主的措施[4]。因此，对病原早期感染的检测非常关键。蜂房球菌因其对培养条件要求严苛并存在显著的竞争优势，所以很难分离出其单菌落[5-6]，且细菌涂片镜检[7]、分离培养[8]、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）[9]等传统检测方法无法满足病原鉴定需要。

本文以中蜂蜂房球菌的16S rRNA基因保守序列（登录号：AB61407.1）为模板设计引物，建立了快速检测蜂房球菌的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法，并用于开展淳安县中蜂欧幼病的流行病学调查，为该地区制定欧幼病的防治措施提供科学依据，并对当地中蜂健康及蜜蜂饲养业的发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集

2017年11月1日至12月31日，根据中蜂场在淳安县的分布密度，从该县17个乡镇的34个中蜂场采集298群蜜蜂样品；每群随机取50～100只工蜂，装入带有炼糖的蜂笼中，活体蜜蜂经CO2处理后立即用液氮冷冻，并置于－80℃冰箱中保存。

1.1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒购自美国Omega公司；1 000 bp DNA标志物、pMD19-T载体、BamHⅠ和HindⅢ（QuickCutTM）内切酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix、Trans2K Plus DNA标志物、感受态细胞Trans1-T1、PCR产物纯化试剂盒和质粒DNA小量抽提试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。无水乙醇等化学试剂均为国产，分析纯。

1.2 欧幼病PCR检测方法的建立

1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank中蜂房球菌16S rRNA基因保守序列（登录号：AB61407.1），利用DNAStar和Oligo 6.24软件设计F/R上下游引物（F：5´-GCGGCTCTC TGGTCTGTAACT-3´；R：5´-TGCTTAACCTCGCG GTCTT-3´），预计扩增的目的片段长度为548 bp，引物由江苏省苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 DNA的提取

选择感染蜂房球菌的中蜂幼虫，经液氮研磨，参照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，并保存于－20℃冰箱中。

1.2.3 PCR退火温度的优化

以提取的DNA为模板，参考所设计引物的退火温度值，优化PCR退火温度。反应体系（50 μL）：DNA 1 μg，2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，用ddH2O补足至50 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，按50～65℃设置温度梯度，退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35个循环；最后，72℃再延伸10 min。PCR反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，以选择最适的退火温度。以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照。

1.2.4 重组质粒构建及双酶切鉴定

将PCR扩增产物克隆到pMD19-T载体上，转化到大肠埃希菌感受态细胞Trans1-T1中，采用蓝白斑筛选、BamHⅠ和HindⅢ双酶切方法筛选包含插入片段的重组质粒。双酶切反应体系（30 μL）：10×QuickCut缓冲液3 μL，阳性重组质粒8 μL，BamHⅠ1 μL，Hind Ⅲ 1 μL，用ddH2O补足至30 μL。反应条件：30℃温育10 min；37℃温育10 min。反应结束后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，然后对阳性重组质粒进行测序，测序结果通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的BLAST进行比对。

1.2.5 特异性试验

以蜜蜂子囊球菌（Ascosphaera apis）、蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）、幼虫芽孢杆菌（Paenibacillus larvae）和蜂房球菌阳性样品的DNA为模板，以本试验设计的引物和最适退火温度进行PCR扩增，以鉴定该方法的特异性。以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照。

1.2.6 灵敏度试验

利用NanoVue紫外分光光度计测质粒DNA的浓度，然后将5 μL模板稀释成拷贝数系数为1的质粒溶液，并依次10倍稀释至0.01 μL－1。每个稀释度取1 μL作为模板进行PCR，根据出现目的条带模板的最大稀释倍数，确定模板浓度并推算最低检出拷贝数。以1.2.4构建的重组质粒作为阳性对照；以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照。

1.2.7 重复性及可靠性试验

选择12份已知阴、阳性的DNA样品，用已建立的方法重复检测3次，验证该方法的重复性；选择阳性PCR产物按照1.2.4步骤进行克隆测序比对，验证该方法的可靠性。

1.3 淳安县欧幼病流行病学调查

1.3.1 样品处理

在采集的298群蜜蜂样品中每群随机取30只工蜂混合研磨，按照1.2.2步骤提取DNA。

1.3.2 病原检测

以1.3.1提取的DNA为模板，用1.2建立的方法对待检样品进行PCR，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。以ddH2O代替DNA模板作为阴性对照。

1.3.3 数据分析

利用Excel 2007软件统计298群中蜂样品的蜂房球菌的感染情况，分析欧幼病在不同乡镇的阳性检出率。

2 结果与分析

2.1 PCR检测方法的建立

2.1.1 退火温度的优化结果

利用1.2.1设计的引物，以欧幼病阳性样品的DNA为模板，设置退火温度为50～65℃，进行PCR。结果（图1）显示，采用本研究建立的PCR方法可从欧幼病阳性样品DNA中扩增出一条548 bp的特异目的条带，其中，退火温度从50℃到63.5℃均能扩增出目的条带。根据条带的亮度及引物的特异性，本文选择59℃作为欧幼病病原检测的PCR退火温度。

图1 PCR的退火温度优化Fig.1 Optimization of annealing temperatures for PCR

2.1.2 重组质粒的鉴定结果

采用TA克隆方法（original T A cloning kit）将PCR产物连接到pMD19-T载体上，获得重组质粒，将其命名为pMD19-T/M.pluton。重组质粒pMD19-T/M.pluton经BamHⅠ和HindⅢ酶切后，电泳检测到2个条带，大小分别在500～750和2 000～3 000 bp之间（图2），与PCR目的片段和pMD19-T质粒片段长度一致，符合预期。然后对重组质粒pMD19-T/M.pluton进行测序和BLAST比对发现，用该方法获得的目的片段与蜜蜂蜂房球菌DAT561菌株的16S rRNA基因序列（登录号：AP018492.1）同源性为100%，说明重组质粒构建成功，且利用已建立的PCR方法可特异性获得预期产物。

2.1.3 灵敏度试验结果

利用NanoVue超微量分光光度计测定阳性质粒DNA质量浓度为275 ng/μL，经换算相当于拷贝数7.77×1010μL－1。以不同稀释倍数的重组质粒为模板进行PCR，结果表明，模板拷贝数从1到10号分别为108到10－1μL－1，均能扩增出清晰、单一的目的条带（图3）。因此，所建立的PCR方法根据拷贝数计算最低检测量为0.1 μL－1，对应的模板浓度为3.44×10－10ng/μL。

图2 重组质粒的双酶切鉴定结果Fig.2 Identification result of recombinant plasmid of pMD19-T/M.plutonby double restriction-enzymedigestion

图3 敏感性试验结果Fig.3 Results of sensitivity test

2.1.4 特异性试验结果

以不同细菌DNA为模板，应用已建立的PCR方法进行特异性检测。结果显示：该方法仅特异性扩增出蜂房球菌，扩增产物大小在500～700 bp之间（图4），与预期一致。而以A.apis、N.apis、P.larvae的DNA为模板进行PCR扩增，均无条带，说明该方法可特异性检测蜂房球菌。

2.1.5 重复性及可靠性验证结果

应用已建立的PCR方法对感染蜂房球菌和未感染该细菌的蜜蜂样品重复检测3次，获得的检测结果一致，表明本文建立的欧幼病PCR检测方法具有良好的重复性；对阳性产物进行克隆测序，经BLAST分析发现，该阳性产物与NCBI公布的17段序列的部分结构蛋白的16S rRNA同源性均在99%以上，说明该方法的可靠性高。

M：DL1000 DNA标志物；1：蜜蜂子囊球菌；2：蜜蜂微孢子虫；3：幼虫芽孢杆菌；4：阴性对照（ddH2O）；5：蜂房球菌。M:DL1000 DNA marker;1:A.apis;2:N.apis;3:P.larvae;4:Negative control(ddH2O);5:M.pluton.

2.2 淳安县欧幼病流行病学调查分析

2.2.1 检测结果

利用本文建立的方法对淳安县的298群工蜂样品进行PCR检测，结果显示，阳性样品的电泳条带单一、清晰易辨（图5）。经统计，总共有75份阳性样品，测序验证表明，有目的条带的样品均呈蜂房球菌阳性，说明该方法可应用于欧幼病病原检测，且效果稳定、可靠。

2.2.2 欧幼病流行病学调查结果

对浙江省淳安县17个乡镇的34个饲养点进行欧幼病流行病学调查，结果（表1）显示：该地区中蜂蜂群内蜂房球菌总检出率为25.2%；在17个乡镇中，仅有6个乡镇未检出蜂房球菌感染，说明该地区约有64.7%的乡镇的中蜂携带有欧幼病病原；在11个存在蜂房球菌阳性的乡镇中，有5个乡镇蜂房球菌检出率≥40%，分别为金峰乡、临岐镇、安阳乡、宋村乡和威坪镇。

图5 部分样品蜂房球菌的PCR检测结果Fig.5 Test results of some samples of M.pluton by PCR

表1 中蜂样品采集信息及蜂房球菌检测结果Table 1 Information of collected samples and detection result of M.pluton

3 讨论

由蜂房球菌引起的欧洲幼虫腐臭病因传播迅速、发病快，容易感染中蜂且病情严重，给我国中蜂养殖业的健康发展带来严重威胁。本研究建立的PCR检测方法是基于蜂房球菌16S rRNA基因保守序列，并通过优化PCR反应条件而建立的。试验证实，该方法特异性强，灵敏度高（DNA检出量最低为3.44×10－10ng/μL），对于进一步精准检测蜜蜂蜂房球菌感染具有重要的指导意义。

欧幼病的爆发具有明显的季节性[10]。在我国南方，每年有2个高发期，一个是3月初至4月中旬，另一个是8月中旬至10月初。如果秋末冬初气温下降不明显，欧幼病秋季发病的时间可能会延长[4]。本文选择在秋末冬初时开展淳安县欧幼病的调查，明确致病菌——蜂房球菌在中蜂蜂群内的携带情况，可为春繁时期病害防控措施的制定提供参考。本次调查发现，在淳安县17个乡镇中有11个乡镇的M.pluton感染呈阳性，说明欧幼病病原在该地区的中蜂中普遍存在。在采样过程中发现，金峰乡和宋村乡蜂场出现“花子”脾面、虫体腐烂带酸臭味[11]等现象，这与欧幼病典型症状吻合，其他一些蜂群也有发病迹象但症状特点不明显。由于此时正值蜜蜂病毒病中蜂囊状幼虫病的高发时期，蜂群如果感染该病后会导致消化系统功能紊乱和免疫力降低，如果再遇到暖冬气候，便为M.pluton提供了适宜的繁殖条件，将出现蜂群细菌与病毒混合感染的复杂病症。因此，细菌病与病毒病混合感染的现象需引起重视，及早干预病害发展进程，减少对蜂群健康发展的影响。

总之，本研究建立了中蜂欧幼病PCR检测方法，灵敏性很高，且利用该方法明确了秋末冬初M.pluton在淳安县的感染情况，为该地区制定欧幼病防治措施提供了数据支撑。但本研究仅在一个时期对千岛湖地区M.pluton感染做了流行病学调查，为了深入了解该地区欧幼病发病情况，有待进一步对该病的病原进行季节性动态检测。另外，在实际生产中，中蜂病害的爆发往往并非单一病原感染所致，所以加强多种病原混合感染的检测，尤其是细菌与病毒混合感染的快速检测方法有待开发。