基于改进的重叠延伸聚合酶链式反应技术快速制备DNA分子质量标准

张圆圆，颜焰，金玉兰，董伟仁，周继勇

（浙江大学动物科学学院，杭州 310058）

DNA分子质量标准是一种用以指示核酸电泳过程中未知DNA样品分子质量大小的标准参照物，是分子生物学实验常用的试剂之一[1-3]。DNA分子质量标准的制备方法可以分为限制性内切酶消化法和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增法2种[4-5]，也有研究者将这2种方法结合使用[6]，但各有其优缺点。

限制性内切酶消化法系利用限制性内切酶对天然的基因组DNA或人工构建的质粒DNA进行酶切，从而得到DNA分子质量标准。由于天然基因组DNA的酶切位点非随机分布，酶切片段的分子质量跨度虽然较大，但片段大小不均，不能人工调控DNA梯状片段的大小和浓度[7-8]；而人工构建的质粒DNA则是一次性把预先设计的各种DNA片段插入到质粒中，很好地解决了上述问题，但质粒构建步骤烦琐，周期较长[8-10]。PCR扩增法能快速有效地扩增目的片段，在制备小片段DNA分子质量标准时优势明显。PCR扩增法又可分为单片段扩增和多重扩增[2,11]，利用这些方法已能制备出DL1000和DL2000 DNA分子质量标准。然而，单片段扩增法需要对每个片段进行PCR扩增，再进行后续混合，各浓度的调配过程费时费力，实验重复性较差[12-14]；多重扩增则是在PCR体系中引入数十对引物，以期通过一次PCR来获得数十个DNA片段，但由于不同片段的PCR参数或扩增效率存在差异，导致优化较困难，可重复性较差[15]。

本研究采用重叠延伸PCR技术来快速制备DNA分子质量标准，具有条带清晰、分子质量准确、条带均一性好、实验成本低等优点，可用于常规的分子生物学实验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 DH5α感受态细胞

用CaCl2法制备大肠埃希菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞，由本实验室保存。

1.1.2 试剂

作为PCR模板的pUC19由本实验室保存。2×TaqMaster Mix(Dye Plus)购自南京诺唯赞生物科技有限公司，DNA分子质量标准DL2000购自宝日医生物技术（北京）有限公司，DNA分子质量标准GeneRuler 100 bp Plus购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，质粒小量抽提试剂盒购自浙江易思得生物科技有限公司。

1.1.3 仪器

MG96G型PCR扩增仪购自杭州朗基科学仪器有限公司，Tanon 2500型全自动数码凝胶图像分析系统购自上海天能科技有限公司，5418小型台式高速离心机购自艾本德（上海）国际贸易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

引物均由杭州尚亚赛生物技术有限公司合成，引物序列及退火温度见表1。

1.2.2 质粒转化与提取

用热激法将pUC19质粒转入E.coliDH5α感受态细胞中，复苏后将细菌均匀涂布于含终质量浓度为50 μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）固体培养基上，于37℃条件下培养过夜后挑取单菌落，接种于2 mL含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、250 r/min条件下振荡培养至对数生长期，用质粒小量抽提试剂盒提取pUC19质粒。

1.2.3 短片段的PCR扩增

本实验涉及2种不同的PCR类型，分别为用于扩增120 bp短片段的普通PCR和用于制备DNA分子质量标准的重叠延伸PCR。普通PCR反应体系：2×TaqMaster Mix 10 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，稀释的pUC19质粒1 μL，加ddH2O补足至20 μL。重复3管。PCR反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性10 s，70 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环；最后，72℃延伸5 min。PCR扩增完成后，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并于4℃条件下保存。

表1 引物序列及退火温度Table 1 Primer sequence and annealing temperature

1.2.4 改进的重叠延伸PCR

以上述扩增的DNA短片段同时作为模板和引物，进行重叠延伸PCR反应，其PCR体系为20 μL，含前述步骤所得的 DNA 片段 2 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，其余用ddH2O补足至20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，50、60或70℃退火30 s，72℃延伸1 min，3～15个循环。在3、6、9、12和15个PCR循环后分别取出1管，以筛选重叠延伸PCR的最佳扩增条件。

1.2.5 琼脂糖凝胶电泳

各吸取3 μL重叠延伸的PCR产物，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳[三羟甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸（TAE）缓冲系统]，在100 V电压下电泳30 min。用Tanon 2500型全自动数码凝胶图像分析系统对凝胶进行扫描并拍照。

1.2.6 DNA分子质量标准的制备

根据电泳结果选择最佳的PCR循环数或不同循环数的最佳组合，并将反应体系累计放大到500 μL，加入100 μL 6×上样缓冲液，混匀，经1.5%琼脂糖凝胶电泳确认DNA分子质量标准的效果，于－20℃条件下保存。

2 结果与分析

2.1 重叠延伸PCR技术用于制备DNA分子质量标准的原理

重叠延伸PCR技术的原理如下：首先用含末端互补序列的引物来扩增不同目的片段，再通过片段间的末端互补序列使不同PCR产物在退火过程中形成部分重叠区域，随后通过PCR延伸反应实现不同扩增片段的拼接，最后以新形成的拼接产物为模板，利用两端引物再次进行PCR，从而得到大量的预期片段。重叠延伸PCR技术在基因的定点突变、核苷酸的缺失或插入、融合基因的构建等方面有其广泛而独特的应用。

本实验对重叠延伸PCR技术进行了改良，主要体现在：1）在整个反应体系中只加入一种PCR片段；2）该PCR片段同时发挥模板和引物的双重功能。具体而言，首先利用普通PCR反应来扩增5´和3´端序列一致的DNA产物，在随后重叠延伸PCR反应的变性和退火过程中，2个单链的3´端互补序列可形成双链，且这些单链片段可同时作为模板和引物，在PCR延伸过程中延长片段；随着反应循环数的增加，小片段产物逐渐减少，大片段产物逐渐增多；只要预先设计好片段长度，即可制备DNA分子质量标准（图1）。

2.2 普通PCR产物的鉴定

根据pUC19载体序列设计引物（表1），以质粒为模板进行PCR扩增。由图2可见，重叠延伸PCR反应所需序列的退火温度虽然不同（55～70℃），但只要与模板匹配的序列一致，普通PCR反应都能扩增出预期的DNA片段，且扩增条带清晰明亮，分子质量大小（120 bp）正确。由于扩增产物5´端和3´端的20 bp完全相同，所以该PCR片段可同时作为后续重叠延伸PCR反应中的引物和模板，用以制备DNA分子质量标准。

图1 重叠延伸PCR技术制备DNA分子质量标准的原理（A）和预期结果（B）Fig.1 Principle(A)and expected result(B)of preparing DNAmarker by overlap extension PCR

图2 普通PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoretogram showing amplified products of conventional PCR

2.3 基于重叠延伸PCR技术的DNA分子质量标准的制备及检测

为探讨重叠延伸PCR技术在制备DNA分子质量标准时是否具有普适性，本实验在设计末端互补序列的退火温度时，温度跨度为55～70℃。从图3可知，在实际退火温度为50、60或70℃的条件下，所有的4种扩增产物均可在重叠延伸PCR反应中实现对片段的有效延伸，且随着循环数的增加，小片段的比例减少，大片段的比例逐步增加，和理论预期一致。

根据重叠延伸PCR的不同循环数，选择合适的循环数或将不同PCR循环数的产物进行混合，即可制备得到DNA分子质量标准。如图4所示，利用重叠延伸PCR技术，制备得到了分子质量大小为（100×n+20）bp的DNA混合片段，其中n为正整数，电泳效果和GeneRuler 100 bp Plus接近，完全可用作分子实验中的DNA分子质量标准参照物。

3 讨论

随着分子生物学技术的快速发展，作为核酸电泳技术中不可或缺的重要组成部分，DNA分子质量标准已被广泛应用于分子生物学实验中。掌握DNA分子质量标准的制备技术，不仅可以为实验室节约经费，而且可根据实验室的实际需求随时自制一种分子质量标准，从而解决常规DNA分子质量标准不能准确指示样品特定DNA分子质量大小的问题[16-18]。

图3 普通PCR的扩增产物在重叠延伸PCR的不同反应条件下经不同PCR循环数后的电泳结果Fig.3 Agarose gel electrophoretogram of the amplification products of overlap extension PCR under different reaction conditions and different cycles

常规的DNA分子质量标准的制备方法包括限制性内切酶酶切法和PCR法。其中：限制性内切酶酶切法涉及细菌的培养、基因组DNA的提取或质粒的构建和提取、酶切等一系列烦琐的步骤[3,19]，制备的周期长、工作量大，限制了其在实验室的普及和推广。PCR技术是分子生物学实验室的一种常规手段，利用PCR技术来制备DNA分子质量标准具有广阔的应用前景。然而，单片段扩增法和多重扩增法需要对扩增产物浓度或PCR体系进行优化，实验难度增加。

图4 重叠延伸PCR技术制备得到的DNA分子质量标准的琼脂糖凝胶电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoretogram showing DNA laddermarker amplifiedby overlapextension PCR

本研究采用改进的重叠延伸PCR技术来制备DNA分子质量标准，具有以下特征：1）在体系中加入的PCR小片段同时作为模板和引物，且PCR片段无须回收。2）重叠延伸PCR反应的退火温度范围广（50～70℃），在引物设计时，对重叠延伸PCR所需末端互补序列的退火温度无特殊要求。3）通过事先设计末端互补序列及中间序列的长度，实验室可根据需求来定制DNA分子质量标准。4）该制备方法取材方便，如可用实验室常见质粒为模板；所有PCR产物无须回收，降低了成本，简化了制作工艺；整个制作只需2次PCR，操作简单。

综上所述，重叠延伸PCR技术提供了一种快速、高效、低成本、可定制化制备DNA分子质量标准的新方法，所得片段大小标准，条带分布均匀、清晰，易于识别，可与商品化的DNA分子质量标准相媲美，可在实验室推广和普及，并具有广泛的应用价值。