牛支原体临洮分离株NOX-1的克隆表达、酶学活性及其亚细胞定位研究

李 丹，张志雄，邢小勇，包世俊

（甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）

牛支原体（Mycoplasma bovis，M. bovis）是牛科动物的一种重要的致病性支原体[1]，感染后主要分布于牛呼吸道和乳腺组织中，可引起牛的角膜结膜炎、肺炎、乳腺炎、关节炎以及生殖道损伤等多种疾病[2-3]。自1961年Hale首次从患乳腺炎的病牛乳汁中分离到M. bovis以来[3]，世界各地相继报道了牛支原体感染相关疫情。目前，牛支原体感染呈世界性分布，包括欧美等许多养牛业发达的国家和地区。2008年我国首次从患有坏死性肺炎的肉牛中分离出支原体，确诊为牛支原体肺炎[6]。目前，我国绝大多数地区发生牛支原体肺炎疫情，给我国养牛业造成了严重的经济损失[7]。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）氧化酶（NADH oxidase，NOX）在有O2存在的条件下，通过催化NADH生成NAD+。NOX可与以NAD+为辅酶的氧化还原酶偶联，在催化氧化还原反应的同时生成NADH，从而使辅酶能够循环再生，产生提高催化反应效率的效果。根据产物的不同，可将NOX分为两类：一类为产H2O2型NADH氧化酶（NOX-1），另一类为产H2O型NADH氧化酶（NOX-2）[8-9]。1996年，Higuchi等[10]对变形链球菌（Streptococcus mutans）的NOX-2基因进行了克隆和原核表达，并将其与粪链球菌（Streptococcus faecalis）NOX-1基因进行比对，发现相似性小于20.4%。1999年Auzat 等[11]通过对肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）NOX的研究，首次发现了酶活性降低会导致病原微生物的适应力及毒力下降。2016年研究人员对蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia）NOX基因进行克隆、表达及结构功能等相关研究，发现NOX蛋白与蓝氏贾第鞭毛虫致病性相关[12]。本研究采用PCR技术对牛支原体NOX-1基因进行扩增，进而完成NOX-1基因原核表达载体的构建、表达，以及表达产物NOX-1在M.bovis内的初步定位，以期为进一步探索NOX的生物学功能以及M. bovis有关后续研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂牛支原体（M. bovis）临洮株由甘肃农业大学动物医学院兽医传染病学实验室分离并保存；大肠杆菌（E. coli）DH5α、BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物有限公司；表达载体pET-28a(+)质粒购自Novagen公司；新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。

限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ、PrimerSTAR®Max DNA聚合酶购自TaKaRa公司；DNA Marker购自CWBio公司；Protein Marken、T4DNA Ligase购自Thermo公司；TMB（四甲基联苯胺）显色试色液、DAB（二氨基联苯胺）底物显示液购自Tiangen公司；Ni-NAT His Bind Purification Kit购自Novagen公司；支原体培养基基础购自Hopebio公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；马血清购自Mhbio公司；Triton X-114、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；羊抗兔HRP-IgG购自Canlife公司；其他试剂均为国产分析纯。

BCA（二喹啉甲酸）蛋白定量试剂盒购自Beyotime公司；DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自Tiangen公司。

1.2 引物合成利用PrimerSelect软件，参照GenBank中M.bovisHubei株NOX-1基因序列（GenBank 登录号：NC_015725.1），并对序列中4个编码色氨酸的密码子TGA进行优化（表1）。

1.3 M. bovis基因组的提取将M.bovis临洮株菌液按10%接种量转接于牛支原体液体培养基，37℃、5%CO2环境中培养35 h，取1.5 mL菌液，9500×g离心10 min，用1×PBS洗涤2次，弃去上清后用100 μL双蒸水（ddH2O）重悬沉淀，沸水浴10 min，冰浴5 min，8000×g离心10 min，上清液即为粗提的M.bovis基因组DNA。

1.4 NOX-1基因的PCR扩增以粗提的M.bovis基因组DNA作为模板，采用PCR扩增得到M.bovis临洮株NOX-1基因。PCR反应体系为40 μL：2×PrimerSTAR®Max DNA聚合酶20 μL，模板（M.bovis基因组）2 μL，上、下游引物各1 μL，双蒸水（ddH2O）16 μL。样品送至金唯智生物科技有限公司进行测序，PCR反应条件见表2。

表1 NOX-1基因overlap PCR的引物序列Table 1 Primer sequences of NOX-1 gene for overlap PCR amplification

表2 PCR扩增条件Table 2 PCR amplification condition

1.5 序列分析应用DNAStar软件对不同分离株的NOX-1基因序列进行比较分析，并构建系统进化树。

1.6 原核表达载体的构建将优化后PCR产物与pET-28a (+)分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收产物于4℃过夜连接后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布含有卡那霉素抗性的LB平板（1.0 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、1.0 g NaCl、1.1 g琼脂粉溶于100 mL蒸馏水中，高温灭菌后加入100 μg/μL卡那霉素75μL），于恒温培养箱中37℃过夜培养，挑取单个菌落进行菌液PCR鉴定，正确的阳性质粒命名为pET-NOX-1，并送金唯智生物科技有限公司进行测序。

1.7 pET-NOX-1原核表达及表达产物的纯化

1.7.1 pET-NOX-1原核表达 取重组表达质粒pETNOX-1转化E. coli感受态细胞BL21，涂布于LB培养基平板，挑取单个菌落于5 mL LB液体培养基中过夜培养后，按1%比例转接于5 mL 2-YT培养基中，待OD值达0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达，并进行SDS-PAGE分析。

1.7.2 目的蛋白纯化 取200 mL经IPTG诱导的菌液在4℃、8000×g离心10 min后弃上清，沉淀用PBS洗涤2次，重悬于10 mL Binding Buffer中，并使用超声波破碎（45%，工作5 s，间歇5 s）。待破菌悬液至透亮后4℃、8000×g离心10 min，上清用0.45 μm滤膜过滤后，应用Ni-NAT His Bind Purification Kit纯化目的蛋白（操作方法参照试剂盒说明），纯化产物使用SDS-PAGE进行分析，最后用BCA蛋白定量试剂盒测定目的蛋白含量。

1.8 His-NOX-1酶促活性及其影响因素的测定

1.8.1 His-NOX-1的酶活性测定 反应体系为2 mL，0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液（pH 7.5）含1 mmol/L 的二硫苏糖醇（DTT），实验组加入His-NOX-1蛋白至终浓度为5 μg/mL，然后加入黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅基至终浓度为10 μmol/L，在25℃作用5 min后加入底物牛支原体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）至终浓度为500 μmol/L，每隔一定时间在OD340处读取数值。同时以不加NADH为对照组，不加His-NOX-1的为空白组，其他反应条件不变。His-NOX-1的比活力计算公式为：

1.8.2 温度对His-NOX-1活性的影响 在pH7.5条件下，分别测定4℃、20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、50℃、60℃时的His-NOX-1酶促活性，每个温度重复测3次。

1.8.3 pH对His-NOX-1活性的影响 以25℃为条件，分别测定pH为2.0、4.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0时的His-NOX-1酶促活性，每个pH值重复测3次。

1.8.4 底物浓度对His-NOX-1活性的影响 利用上述方法在确定最适温度和pH的情况下，分别测定NADH终浓度为50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L、500 μmol/L、1 mmol/L时的His-NOX-1酶促活性，每个浓度重复测3次。

1.9 多克隆抗体的制备及效价的测定将纯化的His-NOX-1与等体积的弗氏完全佐剂混合并充分乳化后免疫新西兰兔，首免剂量为800 μg/只，背部皮下多点注射。首免后2周进行第2次免疫，剂量减半（400 μg/只）并加等体积的弗氏不完全佐剂，之后每隔1周免疫1次，剂量和方法与2免相同。第4次免疫1周后采血，静置后吸取血清，并使用间接ELISA法测定血清抗体效价。

1.10 膜蛋白的提取取200 mL培养至对数生长后期的M.bovis临洮株菌液，8000×g离心10 min后弃掉上清，1×PBS洗涤3次，使用适量PBS悬浮菌体沉淀使之形成原体积150倍浓缩。从中吸取16 μL菌液，加入4 μL的5×上样Buffer制成全菌上样蛋白，在剩余的菌液中依次加入50 μL的蛋白酶抑制剂和终浓度为3% TritonTMX-114后，充分混匀并于4℃静置30 min，37℃水浴10 min。9500×g离心10 min，将上层水相（胞浆蛋白）和下层油相（膜蛋白）分别移入干净的离心管中（弃去水相和油相交界处的液体），分别加入3倍体积的-20℃预冷的乙醇，置-20℃冻存3 h以后，4℃、9500×g离心10 min，弃上清，沉淀于超净台中风干后，分别加入等体积的1×PBS（含8 mol/L尿素）溶解，用于分析His-NOX-1在M.bovis中的分布。

1.11 His-NOX-1在M.bovis内的分布

1.1 1.1 Western blot分析 分别取8 μLM.bovis全菌蛋白、胞浆蛋白、膜蛋白及His-NOX-1蛋白，经SDSPAGE分离后转印至硝酸纤维膜（NC膜）；将NC膜置5%脱脂乳中于4℃封闭过夜后，除去封闭液，加入适量用TBST稀释的His-NOX-1抗血清（1∶2000稀释），37℃孵育2 h后用TBST洗涤3次，每次10 min；加入TBST稀释的羊抗兔IgG-HRP（1∶1000稀释），37℃孵育1 h后用TBST洗涤3次，每次10 min，洗涤后用DAB显色试剂盒显色。

1.1 1.2 ELISA检测 取M.bovis胞浆蛋白和膜蛋白溶液各10 μL，分别加入90 μL包被液中，混匀后移入酶标板的不同孔中，37℃静置1 h后置4℃包被过夜。TBST洗涤3次（每次5 min）后，每孔加入200 μL 5%脱脂乳，37℃孵育3 h。TBST洗涤3次（每次5 min），每孔加入100 μL用TBST稀释的His-NOX-1抗血清（稀释比例1∶2000），37℃孵育1 h。TBST洗涤3次（每次5 min）后，每孔加入100 μL TBST稀释的山羊抗兔IgG-HRP（稀释比例1∶8000），37℃孵育1 h。TBST洗涤3次后，每孔加入100 μL TMB显色液，避光显色10～15 min后加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应，并于450 nm处测定OD值。

2 结果

2.1 NOX-1基因扩增产物的鉴定以粗提的M.bovis基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得NOX-1基因的5个片段及NOX-1基因全长，经1%的琼脂糖凝胶电泳得到1条约1365 bp的目的条带（图1），结果与理论预期相符合。

图1 牛支原体临洮株NOX-1基因的overlap PCR扩增Fig. 1 Overlap PCR amplification of M.bovis Lintao strain NOX-1 gene

2.2 NOX-1基因序列分析M.bovis临洮株NOX-1基因序列与目前国内外牛支原体流行菌株的NOX-1基因序列比较分析结果显示，M.bovis临洮株的NOX-1基因与国内外牛支原体流行菌株的NOX-1基因同源性很高，其中与M.bovisCQ-W70株、M.bovisHB0801株、M.bovisHubei-1株、M.bovis08M株、M.bovisHB0801-P115株、M.bovisHB0801-P150株、M.bovisNM2012株相似性高达99.6%，与M.bovisHB0801-P180 株相似性99.5%，与M.bovisPG45株的相似性达98.5%（图2）。

图2 M.bovis NOX-1基因系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree on NOX-1 gene of M.bovis

2.3 原核表达载体pET-NOX-1的构建构建的原核表达载体pET-NOX-1用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，酶切产物大小与理论预期目的片段大小一致（图3）。

图3 pET-NOX-1的双酶切鉴定Fig. 3 Double endonucleases digestion identification of pET-NOX-1

2.4 His-NOX-1原核表达及表达产物的纯化SDSPAGE检测结果显示，原核表达产物His-NOX-1主要以包涵体的形式表达，大小约为50 kDa，与预期大小一致，且重组蛋白可以上清的形式表达（图 4）。

2.5 His-NOX-1酶促反应活性纯化的重组蛋白His-NOX-1酶促活性测定结果表明，在pH7.5、25℃的条件下，His-NOX-1酶活性随时间的变化如图5所示，因而可得His-NOX-1的比活力为75.9 IU/mg。

2.6 温度和pH对His-NOX-1活性的影响不同温度和pH条件下His-NOX-1酶活性测定结果表明， His-NOX-1的酶促反应最适温度为30℃（图6A），最适pH为7.5，而在pH7.0～pH8.0时His-NOX-1活性较强，当pH低于4.0或高于9.0时酶活性呈显著降低趋势，甚至失活（图6B）。

图4 His-Nox-1原核表达的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of His-Nox-1 expression

图5 His-Nox-1重组蛋白酶活性分析Fig. 5 Analysis of His-NOX-1 activity

2.7 His-NOX-1的米氏常数及最大反应速率在不同底物浓度条件下，通过双倒数作图得到两者之间的关系式：y=7.5825x+0.0292（R2=0.9978）（图7），并且求出His-NOX-1的米氏常数：Km（NADH）=256.41 μmol/L，最大反应速率：Vmax=34.25 μmol/（L·min）。

2.8 血清抗体效价测定新西兰白兔4次免疫后进行心脏采血并分离抗血清，通过间接ELISA法测定抗体效价，结果显示，血清抗体效价在1∶38 400以上。

图6 A pH对His-NOX-1活性的影响Fig. 6A Effect of pH on His-NOX-1 activity

图6 B 温度对His-NOX-1活性的影响Fig. 6B Effect of temperature on His-NOX-1 activity

图7 双倒数曲线图Fig.7 The double reciprocal curve graph

2.9 His-NOX-1在M.bovis内的分布Western blot及ELISA检测结果显示，制备的M.bovisHis-NOX-1兔抗血清能与M.bovis全菌蛋白、纯化的His-NOX-1蛋白、胞浆蛋白及膜蛋白发生特异性结合，在约50 kDa处均有明显的条带（图8），证明M.bovisNOX-1在其细胞膜和细胞浆内均有分布。ELISA检测结果证实，NOX-1在细胞浆内的分布量大于细胞膜（图9）。

图8 His-NOX-1在M.bovis细胞膜和细胞质中含量分布的Western blot分析Fig.8 Western blot analysis of distribution of NOX-1 in the membrane and cytoplasm from M.bovis

图9 NOX-1在M.bovis细胞膜和细胞质中分布的ELISA分析Fig.9 ELISA analysis of distribution of NOX-1 in the membrane and cytoplasm from M.bovis

3 讨论

在1981年，Reinards等[13]就推测出NOX-1型NADH氧化酶的反应机理。对于NOX-1型NADH氧化酶，在电子从NADH传递给H2O2或H2O的过程中会经过O2-中间体。NADH先把电子传递给FAD或FMN的半醌形式（FMNH）再传给O2，形成O2-。O2-再与H+反应生成H2O2。某些NOX-1型NADH氧化酶含有Fe-S簇，电子通过Fe-S簇传给O2，形成O2-。如莱氏阿原体（A. laidlawii）中的NOX-1含有FMN结合域和Fe-S簇，因此通过两种方式都可以得到电子，形成O2-中间体[14]。

包世俊等[15]通过二维电泳技术结合Western blot对滑液支原体WVU1853株免疫相关膜蛋白进行了初步分析，证实了滑液支原体NADH氧化酶为其膜表面的一种免疫原性蛋白质。Zhao等[16]对M.bovisNOX-1研究发现，重组NOX-1对胎牛肺细胞具有粘附作用，是一个潜在的毒力因子，并进一步证实了M.bovisNOX-1的产物为H2O2。本研究通过M.bovisNOX-1基因的克隆、表达、产物酶活性的测定及亚细胞定位，为进一步研究有关NOX-1的生物与功能奠定基础。

本研究参照GenBank中M.bovisHubei株NOX-1基因序列设计特异性引物，利用DNASTAR对目的基因进行初步序列分析，发现序列中存在4个编码色氨酸的密码子TGA，而TGA在大肠杆菌中为终止密码子，可导致该基因在大肠杆菌中进行表达时的终止，这在一定程度上增加了扩增目的基因的难度。因此，本研究设计了5对特异性引物，将序列中的色氨酸密码子TGA突变为同义密码子TGG，先扩增出4个小的基因片段，最后得到总的目的基因。同时，减小了表达载体对NOX-1基因表达、酶活测定的影响。

经过对目的基因表达产物的酶活性进行测定发现，从4℃开始，在不同的温度条件下，随着反应温度的升高，酶促反应逐渐加快，当温度达到30℃时，酶促反应速率达到了最大，之后随温度的升高酶促反应逐渐降低。可能有两方面的原因：一是底物或者辅基的结构发生了改变，二是温度过高导致底物发生了一定程度的降解。His-NOX-1在pH 7.0～8.0之间酶促反应较高，在pH为7.5处出现最高峰，判定pH7.5为最适pH，这一结果与大多数的NADH氧化酶相一致。

Western blot及间接ELISA检测了M.bovis临洮株His-NOX-1的亚细胞定位，结果显示，M.bovisHis-NOX-1在细胞膜和细胞浆中均有分布，且细胞膜的分布量小于细胞浆，这将为M.bovis膜蛋白的研究提供一定的依据。