n-6和n-3 PUFA对优质羊肉生产的影响

文│伍佰鑫 李昊帮（湖南省畜牧兽医研究所）

刘小平（湖南省浏阳市永和镇石佳山羊场）

PUFA 是polyunsaturated fatty acid（多不饱和脂肪酸）的简称，第1个双键出现在脂肪酸碳链甲基端第6个（或第3个）碳原子，称为n-6（或n-3）脂肪酸。降低山羊日粮中的n-6∶n-3 PUFA比率，可改变PPARα（过氧化物酶体增生物激活受体）基因表达、SCD（酰基-辅酶A去饱和酶）基因表达和脂肪生成基因的mRNA（信使核糖核酸）表达，增加羊肉中的亚麻酸和n-3亚油酸含量，从而生产出有利于人体健康的优质羊肉。

近年来，人们越来越注重生产健康肉食，尤其是力求更低的n-6∶n-3多不饱和脂肪酸比率（以下简称n-6∶n-3），以及更高含量的共轭亚油酸（一组位置和几何异构体的C18∶2n-6脂肪酸，以下简称CLA）。n-6∶n-3受反刍动物日粮脂肪酸组成的影响很大，同时影响瘤胃、乳汁和肉中的CLA浓度。

诸多研究表明，CLA具有抗癌、抗脂肪形成、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化和抗炎症作用。反刍动物脂肪是CLA同分异构体最丰富的天然资源之一；特别是顺式-9CLA和反式-11CLA，产生于亚油酸（LA）瘤胃生物加氢转化成硬脂酸的过程，在体组织中去饱和酶形成顺式-9CLA，通过C18∶1内源性转换成反式-11CLA。人类饮食中的顺式-9CLA和反式-11CLA异构体主要来源于反刍动物脂肪。多不饱和脂肪酸是过氧化物酶体增生物激活受体（PPAR）最好的内源或天然激活剂之一；脂肪酸又激活PPARα基因；同源重组导致PPARα基因的突变，会产生过氧化物酶体增生物，抵抗过氧化物酶体β氧化路径的诱导。

为了研究山羊日粮中n-6∶n-3对生长性能、胴体特征、肉质、脂肪酸组成、抗氧化剂活性、肌肉中的（PPARα、SCD酰基-辅酶A去饱和酶）基因表达等参数的影响，马来西亚、伊朗和加拿大的学者联合作了如下研究，对国内生产优质羊肉具有较大的参考价值。

一．研究方法

1.饲养试验。收割新鲜油棕榈叶，取样置于55℃烤箱2天再进行常规分析；其余的-80℃保存备用。21只公山羊（5月龄，平均体重13.66千克，非近亲）分别舍饲在21个木质羊栏（1.2米×1米），羊舍有顶棚，离地0.5米有漏缝地板，试验前入药浴池驱虫。随机采食3种日粮之一，其中的n-6∶n-3多不饱和脂肪酸比例分别是2.27∶1（A组）、5.01∶1（B组）和10.38∶1（C组）。

3种日粮配方中相同的成分是30.0%青储油棕榈叶、17.0%玉米粒、13.3%大豆粉、25.1%棕榈仁饼、8.2%米糠、0.5%矿物质预混料、0.5%维生素预混料、1.0%氯化铵、1.0%石灰石。另外3种成分按ABC组顺序分别是：亚麻籽油1.3%、0.4%、0；棕榈坚果油0.1%、1.0%、1.1%；葵花籽油2.0%、2.0%、2.3%。

3种日粮的化学成分相同：代谢能2.51兆卡/千克、粗蛋白13.00%、粗脂肪7.00%、中性洗涤纤维48.90%、酸性洗涤纤维33.00%、钙0.68%、磷0.36%。

3种日粮的下列参数按ABC组顺序分别是：总饱和脂肪酸含量（C10∶0+C12∶0+C14∶0+C16∶0+C1 7∶0+C18∶0）27.18%、32.99%、32.97%；总单不饱和脂肪酸含量（C16∶1+C18∶1n-9）20.45%、27.99%、27.86%；总的n-3多不饱和脂肪酸含量（C18∶3n-3）13.63%、6.47%、3.44%；总n-6多不饱和脂肪酸含量（C18∶2n-6）30.92%、32.40%、35.68%；n-6∶n-3（C18∶2n-6）/（C18∶3n-3）比率2.27、5.01、10.38。

山羊每天饲喂3.7%体重（干物质）的日粮，每周根据体重变化调整1次。基于70%干物质的精饲料与基于30%干物质的油棕榈叶青储饲料混合均匀，分成2份，每天08∶00和17∶00饲喂。自由饮水、自由舔舐矿物质砖块。预试期3个星期，试验期100天。

2.屠宰测定。试验期末，通过割断咽喉宰杀山羊，在第12至第15肋骨之间采集大约150克背最长肌，-80℃保存直至分析结束。胴体冷藏24小时称重，沿中线锯断成2半，对右半部胴体肌肉（第12至第13肋骨之间）采样，测量对应部位的背膘厚度，运用图像J软件包（美国）分析眼肌面积。将右半部胴体分割成颈部、肩部、胸部、腰部和腿部（共5部分），分别称重、计算（占右半部胴体重的）百分率。每个部分再分割出肉、骨、皮下脂肪和肌内脂肪，称重记录。

3.肉质分析。在山羊屠宰后的第1、3、6天，分别用便携式pH计（美国）测定羊肉样本（5℃）的pH。运用ColorFlex（美国）色泽仪测定羊肉样本（28±2℃，分析的前一天晚上4℃解冻）的亮度（L*）、红度（a*）、黄度（b*）和色彩角（反正切，b*/a*），每个样本测定7次再计算平均值。在山羊屠宰后24小时、3天、6天，各称取大约30克羊肉样本（4℃），搁在25平方厘米正方形网子上，再悬浮在充气塑料袋中48小时，根据前后重量之差计算滴水损失。称取少量羊肉样本置于聚乙烯袋内再80℃水浴，直至袋内温度降低到78℃，用手持探针式体温计（美国）测定袋内温度，随后用自来水冷却15分钟，取出称重，根据前后重量之差计算蒸煮损失。

用剪切力测定装置和质构仪（英国）测定背最长肌样本的剪切力（垂直于肌纤维方向剪切断），剪切力越低，肉就越嫩，反之，肉就越坚韧。运用TBARS（硫代巴比妥酸-反应物质）测定羊肉样本的脂类氧化：取1克肉样置于4毫升的0.15M（M代表摩尔/升）氯化钾和0.1mM抗氧化剂（2,6-二叔丁基对甲苯酚）中均质化；取200微升混匀于TBRAS溶液，95℃水浴60分钟直至变成粉红色；冷却；在提炼物中添加1毫升蒸馏水和3毫升正丁醇；旋涡化；混合物离心（5000rpm）10分钟；运用分光光度计（法国），相对于532纳米的合适空白，读起上清液的吸光度；根据1、1、3、3-氯化四乙铵的标准曲线计算TBARS。

4.脂肪酸甲脂分析。运用三氯甲烷从试验样本和组织萃取总脂肪，经乙醇氢氧化钾90℃皂化10分钟；通过甲醇三氟化硼（14%BF3）酯交换反应（90℃）20分钟，脂肪酸转换成脂肪酸甲脂；通过气-液色谱仪（Agilent7890A）分析脂肪酸甲脂：1微升脂肪酸甲脂（自动进样器）注入配有火焰电离探测器的色谱仪，氦载气流量为1毫升/分钟；运用毛细管柱，在100米×0.32毫米×0.25微米膜厚度下分离脂肪酸甲脂，喷嘴和检测器的温度分别保持在250℃和300℃；毛细管柱在120℃等温操作5分钟，然后在4℃/分钟的速度时编程到250℃，按2℃/分钟的速度增加到170℃，保持15分钟，再按5℃/分钟增加至200℃，保持5分钟，最后按2℃/分钟增加至235℃，保持10分钟；使用已知标准（美国）识别峰值，通过峰值积分自动执行相对定量。

5.实时聚合酶链反应，定量检测组织的PPARα（过氧化物酶体增生物激活受体）和SCD（酰基-辅酶A去饱和酶）的基因表达。山羊屠宰后，快速采集背最长肌、液氮冻结、-80℃保存。运用RNeasy脂类组织微型套件从100毫克冷冻组织中提取总核糖核酸（RNA），运用RNase-FreeDnase装置在RNA纯化过程中完成DNase（脱氧核糖核酸酶）的消化；运用分光光度计、260/280纳米吸光度比值测定总RNA纯度；运用反转录套件（Quantitect德国）将纯化的总RNA（1微克）进行反向转录；用触摸屏（Bio-RadCFX96美国）、绿色PCR快速定量套件中的光学级板（德国），进行实时聚合酶链反应（PCR）。

二．研究结果

1.山羊胴体特征和肉质。随着日粮n-6∶n-3PUFA比率的增加，山羊的屠宰率（p＜0.04）、背膘厚度（P＞0.05）、眼肌面积（P＜0.01）呈线性下降。胴体（无论热的还是冷的）重量、皮下脂肪、肌间脂肪、5部分（颈部、肩部、胸部、腰部和腿部）所占百分率均不受n-6∶n-3影响（P＞0.05）。

山羊宰后6天背最长肌的亮度（L*）高于其他处理组宰后第1天和3天的亮度（P＜0.05），随着宰后天数的延长，所有处理组的红度（a*）和黄度（b*）都降低，但宰后同一天的不受影响；与C组（n-6∶n-3=10.38∶1）相比，A组（n-6∶n-3=2.27∶1）宰后1天及之后背最长肌的亮度（L*）显著降低；随着宰后天数的延长，所有处理组的色度或饱和度值显著降低（P＜0.05），但宰后同一天的不受影响；宰后天数对色彩角无显著影响（P＞0.05）。

山羊宰后1天、3天、6天各处理组的pH类似（P＞0.05）。随着宰后天数的延长，（背最长肌）滴水损失（%）显著加大（P＜0.05）；相对于宰后1天来说，宰后6天的蒸煮损失（%）显著加大（P＜0.05）。宰后1天（背最长肌）C组（n-6∶n-3=10.38∶1）的剪切力最大，但与其他组差异不显著，所有处理组的剪切力随着宰后天数的延长而减小（P＜0.05）。山羊宰后6天，相对于C组来说，A组的TBARS值最高，宰后6天都比宰后1天的高；所有处理组的TBARS值随着宰后天数的延长而增加（P＜0.05）。

2.山羊背最长肌中的脂肪酸含量。在所有鉴别的脂肪酸中，C 1 8∶1 n-9含量最高（41.45%～41.94%），其次是C16∶0（17.96%～18.65%）和C18∶0（14.80%～15.74%）；各处理组日粮中n-6∶n-3不显著影响（P＞0.05）C10∶0、C12∶0、C14∶0、C 1 5∶0、C 1 5∶1、C 1 6∶0、C16∶1n-7、C17∶0、C18∶1n-9。各处理组有18个碳原子的脂肪酸含量几乎相同（66.66%～67.42%）。随着日粮中n-6∶n-3PUFA比率的增大，下列脂肪酸含量呈线性减少：C18∶0（P =0.03）、顺-12反式-10共轭亚油酸（P =0.05）、C18∶3n-3、C20∶5n-3、C22∶5n-3、C22∶6n-3（P =0.001）；而以下列脂肪酸含量呈线性增加：C17∶1、C18∶1反式-11（P =0.01）、顺-9反式-11共轭亚油酸、C18∶2n-6（P =0.01）、C20∶4n-6（P =0.001）。C10∶0呈二次方程式增加（P =0.05）。总的饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸都不受影响（P＞0.05）。总的n-3多不饱和脂肪酸呈线性减少。总的共轭亚油酸异构体呈正线性增长。

3.山羊背最长肌中的PPARα和SCD基因表达。与B组（n-6∶n-3=5.01∶1）和C组（n-6∶n-3=10.38∶1）相比，A组（n-6∶n-3=2.27∶1）呈现更高水平的PPARα（过氧化物酶体增生物激活受体）基因表达（P＜0.05），表明降低日粮中的n-6∶n-3PUFA比率，可上调PPARα基因表达。与C组相比，A组的SCD（酰基-辅酶A去饱和酶）基因表达显著减少（P＜0.05），表明降低日粮中的n-6∶n-3PUFA比率，可下调SCD基因表达。

总而言之，降低山羊日粮中的n-6∶n-3PUFA比率，可增加山羊肉中的亚麻酸和n-3亚油酸含量。日粮n-6∶n-3PUFA比率越低（A组2.27∶1），山羊肉中的n-3亚油酸含量则越高。说明日粮含有较低的n-6∶n-3PUFA比率，通过改变PPARα和SCD基因表达，对脂肪生成基因的mRNA（信使核糖核酸）表达起了重要作用。最低n-6∶n-3PUFA比率的日粮应用，是获取富含n-3亚油酸优质羊肉的有效途径。

三．启示

山羊从5月龄起开始育肥100天左右即上市，育肥前应驱虫。每天上午8点和下午5点各喂1次，每天的饲喂量为山羊体重（干物质）的3.7%，每周调整1次饲喂量。栏内配备微量元素舔砖和自由饮水设施。日粮适宜的化学成分为：代谢能2.51兆卡/千克、粗蛋白13.00%、粗脂肪7.00%、中性洗涤纤维48.90%、酸性洗涤纤维33.00%、钙0.68%、磷0.36%。日粮原料中的油棕榈叶、棕榈仁饼和棕榈坚果油应设法替换成国内容易获得的产品，扩大亚麻籽油和葵花籽油的生产（作物种植）。对于国内产量较大、经常使用的饲料原料，应增加n-6和n-3多不饱和脂肪酸分析指标，以便于山羊养殖者精准制定优质羊肉生产的饲料配方。