果酒残渣废液发酵生化黄腐酸的菌种筛选

2019-07-04董腾达黄莎莎王丽红王婷婷

陕西科技大学学报 2019年4期

杨辉，董腾达，黄莎莎，苏文，王丽红，赵敏，王婷婷

(陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021)

0 引言

黄腐酸(Fulvic Acid)，又叫富里酸，作为腐殖酸的组分之一，由于其具有分子量小，活性基团含量高，官能团种类丰富的特点，使得黄腐酸具有生理活性大、抗絮凝能力强、离子交换能力强、易溶于水等特性[1,2].黄腐酸在农业上的应用广泛，随着科研不断深入，黄腐酸在林业、工业、畜牧业、医药等其他领域也有诸多应用[3].早期的黄腐酸分离提取基于煤炭，产物称为矿源黄腐酸(MFA).后来，研究人员发现以农副产物为原料，人为控制发酵条件，通过微生物的腐殖转化作用，生产出的黄腐酸比矿源黄腐酸具有更强的生理活性、水溶性、抗絮凝等能力[4]，称为生化黄腐酸(BFA).

发酵制备BFA多以固态发酵和液态发酵为主，固态发酵具有原料易得、投资较低、工艺简单等特点[5]，液态发酵制备BFA的研究比较少，具有时间短、高转化率、机械化程度高等特点，但是其成本较高.本试验采用液-固混合的发酵方式，优势在于发酵结束后对发酵物进行固液分离，固体作为有机肥料，液体既能当作液肥直接使用，又可浓缩为黄腐酸[6]，能使果酒发酵废弃物得到高值化的充分利用.

蒸馏醪液和果渣均为工业生产中的下脚料，每年在我国排放量大，目前综合利用不足，造成环境污染和资源浪费.果渣中含有丰富的纤维素、蛋白质、糖类等营养物质.蒸馏醪液中含有大量氨基酸、无机盐、糖类等有机质，营养价值丰富，是转化腐殖酸的重要营养物质，并且蒸馏醪液含有酵母发酵产物，其中不乏BFA成分，但还有大量有机质未被转化成BFA[7].

腐殖酸形成的微生物学说表明，多种微生物联合作用是腐殖酸形成的前提[8,9].因此，本试验以海红果酒生产废弃物为主原料，采用液-固混合发酵方式，对BFA发酵的关键即微生物的筛选进行了探究，企图筛选高产BFA的菌种，增加BFA的产量，旨在为实现果渣和海红果白兰地蒸馏醪液的高价值利用提供新途径，同时为其他果酒产生的废弃物的综合利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

海红果渣、海红果白兰地蒸馏醪液(可溶性固形物含量为28%，BFA含量为18.84%)，府谷县聚金邦农产品开发公司；苹果渣，陕西蓝海果业有限公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉,北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠、重铬酸钾、1,10-菲啰啉、硫酸亚铁铵,天津市科密欧化学试剂有限公司.

1.1.2 仪器与设备

PHS-3C型pH计,上海仪电科学器股份有限公司；WMK-08恒温培养箱,山东潍坊医疗器械厂；HWY-100B恒温培养摇床,上海智城分析仪器制造有限公司.

1.1.3 实验菌种

克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)、保拉迪酵母(Saccharomycesboulardi)、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、绿色木霉(Trichodermaviride)、短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)，均为本实验室提供.

1.1.4 培养基

(1)斜面培养基：细菌培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)、霉菌培养基(PDA培养基)、酵母培养基(YPD培养基).

(2)摇瓶培养基：斜面培养基去掉琼脂部分.

(3)发酵培养基：将海红果蒸馏醪液用氨水调整pH至6.0，取50 mL加入250 mL锥形瓶中，然后加入海红果渣(40 g/L)和苹果渣(20 g/L).

1.2 方法

1.2.1 菌种活化和培养

将1.1.3菌种分别在平板培养基上划线培养，控制酵母生长温度28 ℃，培养48±2 h；细菌生长温度32 ℃，培养48±2 h.然后取一环活化后的酵母和细菌分别接种于摇瓶培养基中进行扩大培养，酵母在28 ℃培养24～28 h，转速为150 r/min；细菌在32 ℃培养25～30 h，转速150 r/min.控制孢子浓度达到1×108个/mL.

控制霉菌生长温度30 ℃，平板培养72±2 h后，用10 mL无菌水将孢子洗下，充分震荡分散孢子，然后加入摇瓶培养基中培养10～15 h，控制其孢子浓度为1×108个/mL[10,11].各菌液镜检无杂菌污染后即可作为本试验的发酵菌剂.

1.2.2 单菌发酵试验

将1.2.1扩大培养好的七个菌种以4%的比例接种到发酵培养基中，在温度30 ℃，pH 6.0，转速150 r/min的条件下发酵4 d后，分别测定BFA含量，与原醪液中BFA含量形成对照，筛选出高产BFA的菌种.各处理重复三次，结果取平均值.

1.2.3 混菌发酵试验

将1.2.2筛选出的优势菌种混合，以4%的总接种量进行双菌、三菌和四菌混合发酵(各菌种等比例接种)，发酵条件：温度30 ℃，pH 6.0，转速150 r/min，发酵4 d后，分别测定各组混合发酵液的BFA含量，与原醪液中BFA含量进行对照，筛选出高产BFA的菌种组合.各处理重复三次，结果取平均值.

1.2.4 菌种配比的确定

将1.2.3筛选出的高产BFA的适宜组合,按表1设计菌种配比进行发酵试验，各组以4%的总接种量接种到发酵培养基中，在pH 6.0，转速150 r/min，温度 30 ℃条件下发酵，每天测定各组发酵液的BFA含量和pH，确定菌种最优配比.各处理重复三次，结果取平均值.

表1 微生物接种方案

1.2.5 测定方法

(1)黄腐酸测定用重铬酸钾容量法[12].

(2)温度测定用温度计进行测定.

(3)发酵物pH值使用pH计测定.

1.3 数据处理与分析

采用SPSS 22.0和Origin8.0软件对数据进行分析.采用LSD法对各处理间的差异进行多重比较.

2 结果与讨论

2.1 BFA单菌发酵试验

根据腐殖酸形成的微生物学说，将实验室保存的七种菌株经液体活化培养后，以4%的量接种到发酵培养基中按设计条件发酵，各菌种发酵液中BFA含量如图1所示.

不同小写字母表示在0.05水平上差异显著；不同大写字母表示菌种：K，克勒克酵母；B，保拉迪酵母；I，东方伊萨酵母；S，酿酒酵母；A，黑曲霉；T，绿色木霉；D，短短芽孢杆菌；CK表示原醪液.图1 菌种对发酵液BFA含量的影响

结果表明：绿色木霉(T)的发酵力最强，其发酵液中BFA含量高达23.68%，相比原醪液BFA含量提高4.84%，且显著高于其他菌株的BFA含量(p<0.05).接种克勒克酵母(K)的发酵液中，BFA含量为22.62%，相比原醪液BFA含量提高3.78%.接种东方伊萨酵母(I)、短短芽孢杆菌(D)和保拉迪酵母(B)的发酵液中BFA含量较低，比原醪液BFA含量的增加量均小于2%.

出现上述结果的原因在于绿色木霉环境适应能力强，营养需求简单，它与黑曲霉都可以分泌多种纤维素胞外酶，具有较强的纤维素降解能力[13].克勒克酵母相比酿酒酵母可以产生更多种类的胞外酶，其中就包括β-葡聚糖酶(β-glucanase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)等纤维素酶，这些胞外酶促进克勒克酵母对多种有机物代谢利用，比酿酒酵母产生更多的代谢产物[14].本试验中,具有纤维素降解能力的微生物将醪液中的有机质代谢成为黄腐酸类物质的同时，分泌胞外酶将果渣中的纤维素、糖类等其他有机质转化成为黄腐酸类物质，使得发酵液中的BFA含量升高.

综上所述，选择绿色木霉(T)、黑曲霉(A)、克勒克酵母(K)、酿酒酵母(S)为BFA发酵的良好菌种，以此进行下一步试验.

2.2 混菌发酵产BFA试验

根据单菌发酵的试验结果，将优势菌种黑曲霉(A)、绿色木霉(T)、克勒克酵母(K)和酿酒酵母(S)经液体活化培养后，等比例接种到发酵培养基中进行混菌发酵试验，发酵条件如1.2.3所示，各组合发酵液中BFA含量测定结果如图2所示.

结果表明：三菌组合发酵液中的BFA含量并不都高于双菌组合，且四菌组合(ATSK)BFA含量低于部分三菌组合，这与刘陶[15]的研究结果不一致，原因可能是本试验中所选菌种的差异而造成的.在腐殖酸形成过程中，当一种微生物的代谢物成为另一种微生物的营养物质的时候，或者说前者可以通过代谢作用消除环境对后者的抑制作用，这说明多种微生物在体系中和谐共生，通过复杂的代谢作用从而提高了生产效率.

本实验中，三菌组合(ATK和ATS)发酵液中BFA含量明显高于双菌组合，这说明这两个组合的菌种协同生长，使得微生物代谢力增强，进而提高BFA的产率，其中三菌组合(ATK)即接种黑曲霉、绿色木霉和克勒克酵母的发酵液中的BFA含量最高，达到27.82%，较原醪液中BFA含量提高了8.98%.双菌组合(SK)即接种克勒克酵母和酿酒酵母的发酵液中的BFA含量最低，只有21.31%，仅比原醪液中BFA含量提高2.47%. 同时，本试验发现BFA含量异常的菌种组合都同时含有酿酒酵母和克勒克酵母，这可能是酿酒酵母和克勒克酵母之间存在抑制作用，阻碍了菌株生长代谢，造成BFA产量降低，其具体原因有待进一步研究.

因此，选择黑曲霉、绿色木霉和克勒克酵母进行菌种配比优化试验.

2.3 菌种配比的确定

对上述试验筛选出的黑曲霉、绿色木霉和克勒克酵母按照1.2.4中试验所设计的方案进行发酵，每天测定pH值和BFA含量，确定菌种最优配比.

2.3.1 菌种配比对pH的影响

pH值(即发酵液酸度)是影响发酵过程和最终产率的关键因素之一.pH值的变化会通过影响菌种细胞膜上电荷的变化来影响菌种的新陈代谢能力.酵母和霉菌适宜在中性或者偏酸性的环境中生长代谢，pH过高或过低，都会影响最终BFA的产量.

图3给出了不同菌种配比对发酵液pH含量的影响，结果显示发酵初期，各菌种在营养充足的条件下快速繁殖，两种霉菌充分利用醪液和果渣中的有机物质，产生糖、氨类等代谢物使得发酵液pH上升，随着发酵的进行，酵母代谢产生多种有机酸等其他产物使得发酵液的pH下降.从图3中可以看出各组合的pH变化都呈先上升后下降的趋势.组合4的克勒克酵母接种比例增大，使得其在发酵液中生长代谢能力增强，pH值下降时间早于其他组合.研究人员发现，由固态发酵产BFA的pH值变化量较大[16]，由于本试验的发酵基质主要是液体，各菌种组合pH值的变化量最大仅为0.9.而对照组由于无任何菌种接入，在整个发酵过程中pH无明显变化.

2.3.2 菌种配比对BFA产量的影响

目前，关于固态发酵产BFA的工艺已比较成熟，根据温度变化大致分为升温、高温、降温和腐熟四个阶段[17].可见，研究发酵过程中温度的变化对分析微生物发酵BFA产量的影响非常重要.本试验发酵基质主要为液体，经测量发现，各组合温度变化不明显，这可能是受30 ℃恒温环境影响而造成的，之后试验中应进一步探讨温度的变化趋势.

菌种配比对发酵液BFA含量的影响如图4所示，对照组在整个发酵过程中BFA含量无明显变化.各试验组都呈现先上升后平稳的趋势.发酵前三天，各菌种在营养充足的条件下迅速繁殖代谢，这一阶段霉菌的生长占优势，通过消耗大量有机质使得发酵液的pH上升的同时，BFA含量持续上升.发酵第三天到第四天，组合4的BFA含量继续快速增长，其它组合BFA含量增速放缓，这可能与组合4中克勒克酵母接种比例增大有关. 克勒克酵母除了代谢产生脂类、酸类等物质外，还具有很强的分泌胞外酶的能力，其中分泌β-葡萄糖苷酶的能力较强[18].混菌发酵可以提高纤维素酶活，也可以改变酶系组分的配比，从而使得纤维素酶的酶解能力提高[19].当克勒克酵母、绿色木霉和黑曲霉混合发酵，可能是通过优化三类纤维素酶的配比，提高酶活，进而促进对发酵基质的分解利用，使得发酵液中BFA含量提高.发酵四天后，各菌种组合的BFA含量变化不显著，原因可能是发酵液中生化黄腐酸的转化已基本结束，这时候发酵培养基中只剩下木质素、水不溶纤维等难以分解的物质.最后各种物质转化过程达到平衡，各组的BFA含量恒定且高于对照组，其中组合4的BFA含量高达30.21%，显著高于其他菌种组合(p<0.05).

因此，选择组合4为最优菌种配比，即黑曲霉、绿色木霉和克勒克酵母的接种比例为1∶1∶2，此时发酵液BFA含量为30.21%.