植物远红光受体——光敏色素A的研究进展

周杨杨，李继刚

中国农业大学 生物学院 植物生理学与生物化学国家重点实验室，北京 100193

对植物来说，光是一种尤其重要的非生物环境因子，既作为植物光合作用的能量来源，也作为一个重要的环境信号，调控植物的生长和发育[1]。植物利用不同家族的光受体感受光照的波长、方向和强度，比如，隐花色素感受蓝光，而光敏色素主要感受红光和远红光[2]。

拟南芥中有5个光敏色素蛋白ü 光敏色素A～E (phytochrome A～E，phyA～phyE)，其中phyA与phyB可以感受并响应绝大部分红光和远红光信号。phyB主要参与植物红光下的生长发育调控，如幼苗红光下的去黄化、成苗的避荫反应和开花调控等；与phyB不同的是，phyA主要参与富含远红光条件下植物由暗形态建成转变为光形态建成的调控[3]。根据在光下的稳定性，可以将光敏色素蛋白分为两种类型：一类是phyA，属于光不稳定型，在光下被快速降解；另一类是phyB～phyE，属于光稳定型[2]。

在过去二三十年中，人们对植物远红光受体phyA的功能与分子调控机制的研究取得了较大进展。本文将对phyA的光化学特性、结构域及功能、信号转导机制、磷酸化调控等方面进行讨论与总结。

1 phyA感受光信号的光化学特性

phyA与其他光敏色素相同，是一类能够形成同源二聚体的可溶性蛋白，其单体分子量约为125 kDa[2]。光敏色素蛋白在细胞质内以脱辅基的形式合成。脱辅基的光敏色素蛋白不能够接收光子，通过自催化共价结合线性的四吡咯环色素小分子(phytochromobillin，PΦB) (图1)，能够组装成具有完整功能的光敏色素全蛋白。PΦB在质体内合成，然后被转运至细胞质中，与光敏色素脱辅基蛋白保守结构域中的半胱氨酸残基形成硫醚键，构成具有生物功能的光敏色素全蛋白[4-5]。

光敏色素全蛋白依赖PΦB接收红光和远红光光子。PΦB在植物中存在两种不同的构象，接收光子后两种构象之间可以相互转换；与之一致的是，与PΦB共价结合的光敏色素蛋白也存在两种构象，且两种构象之间也可以相互转换。在暗处生长的黄化植物幼苗中，光敏色素以非活性的Pr形式合成。接收红光后，Pr形式的光敏色素转变为Pfr形式ü 通常认为Pfr形式是有生物学活性的形式[6](图1)；而Pfr形式的光敏色素吸收了远红光后，又可以转回Pr形式。将在光下生长的植物幼苗转移至暗处培养，其中Pfr形式的光敏色素会以比较慢的速度逐渐转换为Pr形式，这个过程称为暗逆转(dark reversion)[7]。另外，伴随着光敏色素在Pr和Pfr形式之间转换，其蛋白质主体结构发生重排[8-9](图1)。

图1 拟南芥phyA保守结构域示意图及工作模型。PΦB共价结合在GAF结构域第323位的半胱氨酸残基上。Hinge region: 铰链区；NTE：N端延伸区(N-terminal extension)； PAS：Per-Arnt-Sim，Per (period circadian protein，昼夜节律蛋白)，Arnt (Ah receptor nuclear translocator protein，芳香烃受体核转位蛋白)，Sim (single-minded protein，Sim蛋白)；GAF结构域：cGMP 激活的磷酸二酯酶(cGMP-stimulated phosphodiesterase)，鱼腥藻腺苷酸环化酶(Anabaena adenylate cyclases)，大肠杆菌Fh1A(Escherichia coli FhlA)；PHY：光敏色素(phytochrome)；PRD ：PAS相关结构域(PAS-related domain)；HKRD：组氨酸激酶相关结构域(histidine kinase–related domain)

2 phyA蛋白氨基酸序列保守结构域及功能

植物光敏色素蛋白的氨基酸序列具有较高保守性，由大约70 kDa的氨基端与大约50 kDa的羧基端两大部分组成，中间由灵活的铰链区相连接 (图1)。氨基端由4个比较保守的结构域组成，分别为N端延伸区(NTE)、Per-Arnt-Sim(PAS)、GAF和PHY；而羧基端由含有两个PAS的PAS-相关结构域 (PRD)以及组氨酸激酶相关结构域(HKRD) 结构域组成[2-3](图1)。

NTE和PRD是植物光敏色素特有的两个结构域，而其他结构域在不同物种的光敏色素之间相对保守[3,5,10]。GAF结构域主要负责光信号的接受，四吡咯环色素小分子与此结构域中保守的半胱氨酸残基共价结合(图1)。GAF与PAS结构域充当连接酶的角色，负责催化色素小分子与半胱氨酸残基共价结合[3]。PAS结构域也参与蛋白-蛋白的相互作用，或作为光照、氧含量和氧化还原电位变化的响应模块，或作为接受并传递信号的桥梁[8,11]。虽然HKRD是组氨酸激酶相关结构域，但是其氨基酸序列中缺失保守的组氨酸残基，可能是进化不彻底残留的片段[12]。光敏色素的羧基端结构域也是二聚化结构域，而且这个较大的结构域约占整个蛋白质分子的一半[8](图1)。在光敏色素氨基端与羧基端两大结构域之间，有一段灵活的氨基酸序列被称作铰链区。铰链区可能在光敏色素Pr与Pfr形式相互转换的过程中具有关键调控作用。

对光敏色素羧基端结构域的点突变体研究发现，无论是phyA还是phyB，羧基端结构域的点突变均不影响光信号的感受和红光/远红光的可逆转换，但是突变后其作为光受体的生物学功能受到一定程度的影响[8,13]。因此，目前认为光敏色素的氨基端结构域负责接收光信号，而羧基端结构域主要负责信号的传递。结构域的互换与缺失实验进一步证明了这个观点，即使phyA与phyB的羧基端互换，也不影响光信号的传递[14]。对phyA铰链区的最新研究表明，phyA铰链区的氨基酸序列并不保守，却可能包含重要的调控位点[15]。虽然对光敏色素不同结构域的功能均有所研究，但是植物光敏色素全长蛋白的晶体结构仍未被解析。

3 phyA成为植物中唯一远红光受体的机制

phyA是植物中唯一的远红光受体。与之相一致的是，phyA具有区别于其他光敏色素的分子与生化特性。首先，在暗下生长的黄化幼苗中，phyA仅定位于细胞质中，而有少量的phyB定位于细胞核中。远红光、红光与蓝光均能够有效诱导phyA进入细胞核，而远红光不能诱导phyB进入细胞核；且phyA进入细胞核非常迅速，仅需要几分钟，phyB入核则需要数小时[2,16-17]。其次，phyA在光照后被迅速降解，而phyB～E的蛋白水平在光下则相对比较稳定[18]。

虽然phyA在光照条件下能够在极短的时间内进入细胞核，但是在phyA的氨基酸序列中并未发现典型的核定位信号(nuclear localization signal，NLS)，所以人们猜测phyA进入细胞核需要其他蛋白的辅助。研究发现，在拟南芥中确实有两个同源蛋白üüFHY1 (FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL1) 和FHL(FHY1-LIKE)辅助phyA入核。早在1993年，人们就通过筛选远红光不敏感突变体，获得了fhy1、fhy2和fhy3突变体[19]。其中最早被克隆的FHY2被证明是PHYA，而FHY1与FHY3随后也相继被克隆[20-21]。通过同源比对的方法，人们发现拟南芥中还有一个FHY1的同源蛋白FHL[22]。进一步的研究发现，FHY1与FHL是一类保守的植物特有的小蛋白，分别为202和201个氨基酸[23-24]。有意思的是，它们的氨基端结构域中既含有一个核定位信号(NLS)，也含有一个核输出信号(nuclear export signal，NES)，羧基端则有一个保守的结构域[20,22]。FHY1/FHL不仅可以通过羧基端互作形成同源或异源二聚体[22]，还能够与phyA的氨基端和羧基端结构域都相互作用[15,25]；而且，FHY1/FHL与phyA的结合位点相距NLS和NES足有100～150个氨基酸，而这段中间序列在不同物种的FHY1/FHL序列中保守性非常低。有趣的是，如果将这段序列替换成黄色荧光蛋白 (yellow fluorescent protein，YFP)，也不影响FHY1的功能[23]。

FHY1与FHL同时突变以后，突变体对远红光极不敏感[22,25-26]；而且研究表明，它们的细胞质与细胞核定位信号是其行使功能的关键。荧光淬灭恢复 (FRAP) 和荧光淬灭损耗 (FLIP) 实验显示：FHY1为穿梭蛋白，印证了其同时含有核定位信号与核输出信号。酵母双杂交实验结果证明，FHY1与FHL结合Pfr形式的phyA[1,25,27-28]。因此，在胞质中Pfr形式的phyA与FHY1和FHL结合，依靠后者的核定位信号将phyA转运进入细胞核[1,23,25,29]；在细胞核中，FHY1和FHL与phyA脱离后回到细胞质，进入下一个转运phyA进入细胞核的循环(图2)。正是因为FHY1/FHL转运的高效性，phyA在照光后能够迅速进入细胞核。但是FHY1和FHL只负责phyA的转运，并不参与phyB的入核[25]。在fhy1fhl双突变体中，phyA无法进入细胞核，所以无法起始phyA信号响应。fhy1 fhl双突变体的表型与phyA突变体几乎相同，也反映了phyA主要在细胞核中诱导光信号反应。

既然phyA的入核依赖FHY1/FHL的转运，那么能够调控FHY1/FHL基因表达或者蛋白功能的因子，也可能调控phyA进入细胞核。FHY3与其同源蛋白FAR1 (FAR-RED IMPAIRED RESPONSE1)就是很好的例子。FHY3基因克隆后，发现其与先前克隆的另一个远红光信号调控基因FAR1同源[21,30]。2007年，FHY3/FAR1的功能及作用机制被研究清楚，发现FHY3与FAR1能够特异地结合FHY1和FHL启动子区的FBS(FHY3/FAR1 binding site)元件，并激活FHY1和FHL的转录，从而调控phyA在细胞核内的积累及远红光信号响应[31]。FHY3/FAR1的氨基端含有C2H2锌指DNA结合结构域，羧基端具有转录激活活性，因此FHY3/FAR1是新发现的一类转座酶衍生的转录因子。在fhy3 far1双突变体中phyA不能定位于细胞核，证明FHY3/FAR1间接调控phyA进入细胞核[31]；而组成型定位于细胞核的phyA能够回补fhy3突变体远红光不敏感的表型，进一步证明FHY3/FAR1确实参与调控phyA的入核[23]。

phyA在幼苗照光后被迅速降解，研究表明phyA的降解依赖重要的光信号负调控因子组成型光形态建成1 (CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC1，COP1)。COP1是保守的E3泛素连接酶，能够与SPA (SUPPRESSOR OF PHYA-105)蛋白形成E3泛素连接酶复合体，泛素化并降解phyA[32-36]。COP1最早是在模式植物拟南芥中被克隆鉴定，是植物光形态建成的抑制因子[32,37]。多年的研究表明，COP1不仅参与植物不同发育阶段的调控，还在哺乳动物中调控细胞的生长、代谢及存亡[38]。COP1主要包含三个结构域：氨基端的RING-finger结构域、羧基端的WD40 重复结构域，以及中间部分的卷曲螺旋(coiled-coil)结构域[37-38]。其中，WD40结构域能够直接与phyA的PRD结构域相互作用[35]。

SPA1最初也是鉴定为光形态建成的负调控因子[39]，随后在拟南芥基因组中又发现了三个同源的蛋白，命名为SPA2、SPA3和SPA4[40-41]。生化实验结果表明，COP1能够与SPA蛋白直接相互作用[34,42-43]，而且phyA也可以与SPA1相互作用[36,44-45]。有意思的是，SPAs蛋白可以形成同源或者异源二聚体，然后与COP1结合组成COP1/SPAs复合体[46]。Co-IP实验证明，COP1对phyA进行的泛素化降解与COP1/SPAs复合体紧密相关，而且COP1/SPAs复合体优先结合磷酸化形式的phyA[15,6,47]。

随着实验技术的更新与新实验方法的引入，人们开始逐渐理解phyA成为植物唯一远红光受体的机制。人们根据遗传与生理、生化实验结果构建了phyA的数学模型，结果表明光可逆转换与FHY1/FHL的转运决定了phyA能够成为远红光受体[1]。尽管phyA与phyB对光谱的吸收非常相似，但是二者还是有许多不同的特性，比如进入细胞核的方式以及光稳定性有明显差异，这些可能是导致phyA活性峰值向远红光偏移的原因[17,27]。拟南芥phyA第242位酪氨酸突变为组氨酸(phyAY242H)会导致phyA组成型锁定在有活性的Pfr形式，能与FHY/FHL组成型互作[1,48]；但是令人意外的是，phyAY242H在细胞核中的积累反而显著降低。原因可能是组成型Pfr形式的phyA将FHY1/FHL困在了细胞核内，使FHY1/FHL无法高效地转运phyAY242H进入细胞核[1,23,48]。同时，在细胞核内phyA由Pfr形式向Pr形式转换后，才能发生phyAFHY1/FHL复合体的分离以及分离后FHY/FHL循环进入细胞质的过程，而这些过程被phyAY242HFHY/FHL的组成型结合所阻碍[1]。phyA的数学模型还预测，除了FHY1/FHL依赖的phyA转运入核机制以外，还存在其他平行的调控机制才能完全符合植物中观察到的phyA活性最高的有效波长，但是目前还不清楚这些可能的机制[1,49-51]。

4 phyA的下游信号转导及负反馈机制

phyA进入细胞核以后，如何向下游传递远红光信号？远红光信号转导途径中，还有哪些重要的组分？其功能和作用机制又是怎样的呢？对于这些问题，下面将作简要介绍。

在光信号转导途径中，转录因子HY5发挥着核心的调控功能(图2)。HY5在较广的波长范围内均能够促进光形态建成，如远红光、红光、蓝光和紫外光[53-55]。研究结果显示，HY5蛋白的水平与拟南芥幼苗光形态建成的程度呈正相关[54]。全基因组的染色质免疫共沉淀-芯片(ChIP-chip)分析表明：HY5在拟南芥全基因组上有数量众多的结合位点，这些结合位点主要位于已注释基因的启动子区域[56-57]。HY5调控的光应答基因，约占全部光应答基因的20 %[58]；光信号通过HY5的作用，能够迅速改变光应答基因的表达。因此，在幼苗光形态建成中，HY5是较上游的转录级联反应的调节因子[56]。

在细胞核中，COP1通过其WD40结构域与HY5直接互作并将其泛素化，HY5随后通过26S蛋白酶体途径被降解[33,59]。在这个过程中，主要的光受体(比如光敏色素与隐花色素)可以在光下特异的促进HY5蛋白的积累，从而促进光形态建成。这里可能有两个主要的分子机制：一是光照条件下COP1由细胞核定位转为细胞质定位[54,60]；二是被光激活的光受体(包括phyA和phyB)可以抑制COP1/SPA形成E3泛素连接酶复合体，从而促进HY5蛋白的积累和光形态建成[45](图2)。

除了HY5这类光形态建成的重要正调控因子，植物中还存在一类被称作光敏色素相互作用因子(phytochromeinteracting factors，PIFs)的蛋白，是植物光形态建成的负调控因子。PIFs属于bHLH家族转录因子，主要在暗下积累。phyA可以与PIF1和PIF3直接相互作用，在光下促进它们的磷酸化和泛素化降解，解除其对光形态建成的抑制作用[61-62]。最近的研究表明，phyA可能是PIFs的激酶，能够在体外磷酸化PIFs蛋白[63]。

在远红光下，伴随着phyA在细胞核中不断积累，远红光信号逐渐增强；先前的研究表明，存在phyA信号的负反馈调控机制，在phyA信号起始后能够抑制FHY1/FHL的转录[20,31]，从而避免phyA信号过度响应 (图2)。研究表明：转录因子HY5在细胞核中积累后，一方面可以与FHY3/FAR1相互作用，阻止FHY3/FAR1结合FHY1/FHL的启动子；另一方面可以直接结合FHY1/FHL启动子区的ACEs元件(ACGT-containing elements)，且ACEs距离FHY3/FAR1的结合位点很近(<10 bp)。因此，HY5的结合能够阻碍FHY3/FAR1对FHY1/FHL的转录激活作用[24](图2)。通过这两种作用机制，HY5在远红光下负反馈调控FHY1/FHL的表达。

图2 拟南芥远红光受体phyA信号转导模式图。FHY1/FHL转运Pfr-phyA进入细胞核。 FHY3/FAR1激活FHY1/FHL的转录。phyA抑制COP1/SPA1复合体功能从而促进HY5的积累；HY5抑制FHY3/FAR1对FHY1/FHL的转录激活，负反馈抑制phyA进入细胞核；同时phyA也可以通过抑制FHY3/FAR1的转录进行负反馈。Pr:phyA的红光吸收形式(R-absorbing form of phyA，无活性)；Pfr: phyA的远红光吸收形式(FR-absorbing form of phyA，有活性)

此外，被光激活的phyA也调控FHY1的蛋白磷酸化和降解。FHY1在黄化的幼苗中积累，幼苗照红光以后FHY1被快速降解，该过程由phyA介导[64-65]；而磷酸化形式的FHY1生物活性降低，原因可能是FHY1的磷酸化抑制其将phyA运载进入细胞核的能力[66]。除了上述负反馈机制外，远红光信号转导途径中是否还有其他的负反馈机制，有待进一步研究。

5 phyA的磷酸化调控

在30多年前，人们就发现光敏色素是能够被磷酸化的蛋白[67-68]，而且发现光敏色素可以自磷酸化[69-70]。进一步的研究表明，光敏色素可能是与组氨酸激酶同源的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[71]。经过多年的研究，人们发现了光敏色素能够在体外磷酸化的底物，包括组蛋白H1[67,70]、PKS1 (phytochrome kinase substrate1)[72]、蓝光受体cry1与cry2[73]、Aux/IAA (Auxin/indole-3-acetic acid)蛋白[74]、穿梭蛋白FHY1/FHL[26]、PIFs蛋白[63]以及光敏色素自身。人们很早就发现幼苗照光后，PIFs蛋白在植物体内被迅速磷酸化和降解，而该调控过程依赖光敏色素[61-62,75]。最近的研究结果显示，phyA可以在体外直接磷酸化PIFs，而且激酶活性区域可能位于phyA的PASGAF-PHY结构域[63]。但是，光敏色素究竟是不是植物体内磷酸化PIFs蛋白的激酶，目前还有争论[76] 。

在多年前，人们以燕麦phyA为对象进行了深入的研究，发现燕麦phyA蛋白上有三个磷酸化位点，分别是NTE结构域的第8和18位的丝氨酸，以及铰链区的第599位丝氨酸[2]。第8位的丝氨酸在燕麦phyA处于Pr与Pfr两种形式均能被磷酸化，而第599位的丝氨酸只有燕麦phyA处于Pfr形式才能够被磷酸化[77-78]。体外磷酸化实验结果表明，第8和18位的丝氨酸为燕麦phyA的自磷酸化位点，这两个位点突变为丙氨酸后，燕麦phyA的自磷酸化严重缺失[79]；但是第599位丝氨酸不是自磷酸位点[79-80]，说明这个位点可能由其他激酶磷酸化。尽管人们对光敏色素的互作蛋白进行过饱和筛选，但是到目前为止还没有发现能够特异磷酸化光敏色素的蛋白激酶[2]。

然而，人们迄今为止发现了多个蛋白磷酸酶，能够催化光敏色素的去磷酸化。比如，蛋白磷酸酶FyPP(flower specific, phytochromeassociated protein phosphatase)可以与光敏色素互作并将其去磷酸化[81]。在拟南芥中过表达FyPP延迟开花，降低FyPP的表达则促进开花，表明在拟南芥中FyPP参与光敏色素介导的开花调控[81]。利用全长拟南芥phyA进行酵母双杂交筛选，获得一个蛋白磷酸酶PAPP5(phytochrome-associated protein phosphatase 5)，它与phyA和phyB均互作，可以催化燕麦phyA三个磷酸化位点的去磷酸化[82]。另一个磷酸酶PAPP2C(phytochrome-associated protein phosphatase 2C)也能够与phyA和phyB相互作用，并且可以在体外催化光敏色素的去磷酸化[83]。

光敏色素的磷酸化与去磷酸如何调控其功能呢？研究表明，phyA的前20个氨基酸中富含丝氨酸残基，如果将这些丝氨酸替换为丙氨酸，或者缺失这20个氨基酸，均增强phyA的活性，表明这些丝氨酸能够抑制phyA的功能[79,84-87]。进一步的研究表明，突变形式的phyA活性增强，是由于phyA的蛋白稳定性增强[79]。因此，phyA的NTE序列中丝氨酸的磷酸化，能够调控phyA的蛋白稳定性。然而，燕麦phyA铰链区第599位丝氨酸的磷酸化并不影响其蛋白稳定性[80]，却阻碍phyA突变体与信号传递因子(比如NDPK2与PIF3)的相互作用，表明燕麦phyA第599位丝氨酸的磷酸化可能作为信号开关，调控光敏色素与下游信号传递因子之间的相互作用[80]。此外，如果将phyA的第599位丝氨酸残基突变为赖氨酸，phyA的自磷酸化以及对PKS1的磷酸化不再受光调控[72]。这些结果表明，第599位丝氨酸的磷酸化可能也参与调控光敏色素的激酶活性。

尽管人们先前对燕麦phyA的磷酸化进行了深入的研究，但是直到2008年，才首次报道了拟南芥phyA在远红光下可以在体内被磷酸化。进一步的研究表明，磷酸化形式的phyA可能是COP1/SPAE3泛素连接酶复合体优先结合并降解的底物[36]。最近的研究发现，一个远红光信号传递的新组分TZP (TANDEM ZINC-FINGER/PLUS3)能够在远红光下调控phyA在体内的磷酸化，而且磷酸化形式的phyA在远红光信号传递中可能扮演重要的角色[47]。此外，还有研究报道了拟南芥phyA铰链区的第590位丝氨酸、第593位苏氨酸和第602位丝氨酸调控phyA的蛋白磷酸化和功能，如果将3个位点同时突变为丙氨酸或者天冬氨酸，均显著削弱phyA的功能以及phyA在远红光下的磷酸化水平[15]。研究结果还显示，Pfr形式的phyA在细胞核中被磷酸化，而且磷酸化phyA的水平与phyA的活性程度呈正相关，表明磷酸化形式的phyA可能是活性更强的形式[15]。

6 总结与展望

随着实验技术与方法的发展与更新，植物远红光受体phyA的功能及其信号传递机制正在不断被揭示，但是，仍有许多重要的问题急需解决。比如，植物体内有哪些激酶可以磷酸化phyA？拟南芥phyA在体内的磷酸化位点有哪些？phyA蛋白是否还有其他的修饰？生物学功能是什么？此外，植物phyA全长蛋白的结构，包括Pr和Pfr构象转变的结构基础，目前仍不清楚。随着研究的不断深入，人们将会进一步理解phyA如何成为植物中唯一的远红光受体，这将为提高作物的光能利用率以及耐荫、耐密植作物新品种的培育奠定重要的理论基础。