醋两头尖炮制工艺及作用评价

2019-07-03付要赵凌赫一鸣蔡广知李剑男贡济宇

特产研究 2019年2期

付要，赵凌，赫一鸣，蔡广知，李剑男，贡济宇

（长春中医药大学，长春 130117）

两头尖为毛茛科植物多被银莲花（Anemone raddeana RegeL）的干燥根茎，性味辛、热，有毒，归脾经，有祛风湿、消痈肿的功效，用于治疗风寒湿痹、四肢拘挛、骨节疼痛、痈肿溃烂等，为治疗风湿病的要药。两头尖醋制品出自古方《再造丸》，为其主要原料，在北京市2008版[1]中药饮片炮制规范中收载有醋两头尖饮片。目前，关于醋两头尖炮制工艺及炮制作用的研究鲜见报道，因此，对醋两头尖的炮制工艺条件进行了研究，以便规范醋两头尖饮片的炮制工艺，研究醋制前、后两头尖毒性及抗炎作用的变化，探究醋制对两头尖的作用[2]。

1 材料

1.1 仪器

1260 HPLC仪（美国Agi1ent公司）；AB135-S型电子分析天平〔梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司〕；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S24电热恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）。

1.2 试剂与试药

两头尖购于吉林省仙草医药药材有限公司，由长春中医药大学中药鉴定教研室蔡广知副教授鉴定；竹节香附素A（RDA）对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111712-201702，纯度≥98%）；米醋（市售，总酸≥90.0 g/L，以乙酸计）；乙腈、甲醇〔色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司〕；其余试剂均为分析纯；水为超纯水；弗氏完全佐剂（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：AC-0051）；IL-1、IL-6和TNF-E1ISA试剂盒（上海源叶生物技术有限公司）。

1.3 试验动物

昆明种小鼠80只，SPF级，雌、雄各半，体重18～22g；SD雄性大鼠60只，220～240 g，均由吉林省长春市亿斯实验动物中心提供。

2 试验方法

2.1 醋制工艺优选

2.1.1 考察指标的确定因中药炮制机制的复杂性，单一化学成分的变化很难诠释炮制效果的好坏，故采用外观性状与化学活性成分变化双重指标综合加权优选炮制工艺。

外观性状：参考北京市中药饮片炮制规范2008年版“醋两头尖”规定[1]，选用断面色泽及气味2个外观性状指标进行工艺评价。外观性状评分见表1。

表1 外观性状评分Tab1e 1 Appearance traits score

化学活性指标成分：两头尖药材有效成分主要为总皂苷及单体皂苷竹节香附素A[3]。前期研究表明，不同炮制工艺条件下，其总皂苷含量无明显变化，而单体皂苷竹节香附素A含量有明显变化，故选取单体皂苷竹节香附素A作为化学评价指标。

对照品溶液的制备参照《中国药典》2015版两头尖“含量测定”项下对照品及供试品的制备工艺[4]。精密称取竹节香附素A对照品适量，分别制成1mg/mL的对照品溶液及 0.42、0.84、1.05、1.47、1.89、2.10mg/mL的系列混合对照品溶液。

供试品溶液的制备参照《中国药典》2015版两头尖“含量测定”项下对照品及供试品的制备工艺[4]。取供试品粉末（过3号筛）5 g，置索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流提取3h，提取液回收溶剂至干，残渣加水10 mL溶解，用乙醚振摇提取2次（20、10 mL），弃去乙醚液。水液用水饱和正丁醇振摇提取5次（20、20、15、15、15mL），合并正丁醇液，减压回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱条件色谱柱：Hypersil ODS-C18（4.6 mm 250mm，5m）；流动相：乙腈A-0.1%磷酸溶液B进行梯度洗脱（表2）；检测波长：206 nm；进样量：10L；理论板数：按竹节香附素A峰计算应不低于4 000。标准品和样品色谱图见图1。

表2 梯度洗脱Tab1e 2 Gradient e1ution

图1 标准品（A）、样品（B）色谱图Fig.1 Standard（A）、sample（B）chromatogram

综合评分：以外观性状及RDA含量为考察指标进行加权。药材炮制的效果一般均以炮制后饮片外观性状来判断，故设定外观性状占60%，RDA含量占40%。

综合评分=（断面色泽评分+气味评分）60%+RDA含量/同组最大RDA含量 100%40%

2.1.2 单因素试验参照北京市中药饮片炮制规范2008年版“醋两头尖”炮制工艺[1]，针对加醋量、闷润时间、炒制温度、炒制时间4个因素，进行不同水平的单因素考察[5]。

2.1.3 正交试验在最佳加醋量下，考察闷润时间（A）、炒制温度（B）及炒制时间（C）3个因素对两头尖醋制工艺的影响，D为空白因素，每个因素设3个水平，采用L9（34)正交试验设计对A、B、C及D进行优选，每组试验平行3次。正交试验因素与水平见表3。

表3 正交试验因素与水平Tab1e 3 Factors and 1eve1s of orthogonal test

2.2 药理试验

2.2.1 样品制备试验分优选醋两头尖饮片组和对照组（两头尖药材）2组。2组各取200g，加水浸泡30min，加入6倍量水，煎煮3次，每次1h，过滤，合并滤液[6]，浓缩成浸膏，80℃烘干至恒重，冷却研磨成粉末，备用。

2.2.2 小鼠急性毒性试验取SPF小鼠80只，雌、雄各半，随机分为对照组（两头尖药材）、最佳工艺炮制的醋制品2大组；每组分为4小组，依次取适量粉末加入0.05%CMC-Na溶解最大剂量组（0.4246g/mL）、1/2剂量组（0.2131g/mL）、1/4剂量组（0.1062g/mL）、1/8剂量组（0.052 5 g/mL），每组10只。各组禁食不禁水12 h后，灌胃给药1次，给药后小鼠自由进食饮水。灌胃后24h内观察受试动物的情况，以后每天观察3次，连续7d，记录各组动物的体重、进食、进水情况、行为活动、精神状态及存活情况[7]。

2.2.3 弗氏完全佐剂致大鼠足肿胀试验取雄性大鼠60只，随机分为模型组、阳性对照组、两头尖组、醋两头尖组。空白组与模型组给予生理盐水10mL/kg，阳性对照组给予甲氨蝶呤片5mg/kg，两头尖及醋两头尖均按0.3 g/kg灌胃给药，每天1次，连续6 d。末次给药1 h后，将大鼠右后足皮下注射弗氏完全佐剂0.1 mL，测定造模后 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 和 6.0h右后足容积，给药后右后足容积与给药前之差作为肿胀度。取各组大鼠血液，备用，将大鼠处死。

肿胀度抑制率=（模型组肿胀度-给药组肿胀度）/模型组肿胀度 100%

2.2.4 炎性因子的测定取足肿胀试验大鼠血液样品，按照E1ISA法检测IL-1、IL-6、TNF-炎症因子，并在450 nm处测定OD值[8]。

3 结果与分析

3.1 竹节香附素A含量测定方法学考察

3.1.1 线性关系吸取配制好的混合对照品溶液，进样测定，进样体积为10L，以峰面积（A）为纵坐标、样品浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程：Y=6.12E+0.6x+41 179.19（r=0.999 2），在 0.42～2.10 mg/mL时RDA与峰面积线性关系良好。

3.1.2 精密度取对照品溶液，重复进样6次，每次10L，按色谱条件测定，以RDA峰面积计算RSD值为0.79%，表明仪器精密度良好。

3.1.3 稳定性称取醋两头尖粗粉约5 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，分别放置0、4、8、12、24 h后进样，进样量10L，按色谱条件测定，以RDA峰面积计算RSD值为1.42%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.1.4 重复性平行称取同批醋两头尖粗粉6份，按供试品溶液制备方法制备，分别进样10L，按色谱条件测定，以RDA峰面积计算RSD值为1.13%，表明方法重复性良好。

3.1.5 加样回收率称取已知含量的供试品2.5g，精密称定，按1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5加入RDA对照品，各平行3次，按供试品溶液制备方法制备，计算平均回收率为98.44%，RSD值为1.81%，表明该方法加样回收率良好。

3.2 单因素试验结果

3.2.1 加醋量取净两头尖10份，各100g，每2份平行为1组，分别加入质量为两头尖质量的10%、15%、20%、25%和30%食用醋，拌匀、闷润，待醋被吸尽、润透后，文火炒干，取出，晾凉，进行测评，结果见表4、图2。由表4和图2可知，加醋20%的炮制效果最佳。因此醋两头尖炮制用醋量为20%。

表4 加醋量考察结果Tab1e 4 Resu1ts of different propotion of vinegar

图2 加醋量考察结果Fig.2 Resu1ts of different propotionsof vinegar

3.2.2 闷润时间取净两头尖10份，各100g，每2份平行为1组，加入20%食用醋，拌匀，分别闷润0.5、1.0、2.0、3.0、4.0h，文火炒干，取出，晾凉，进行测评，结果见表5、图3。由表5和图3可知，闷润时间为2 h时炮制效果最佳。因此闷润时间定为2 h。

3.2.3 炒制温度取净两头尖10份，各100g，每2份平行为1组，加入20%食用醋拌匀，闷润2 h，分别在80、100、120、140、160 ℃下炒制，炒干，取出，晾凉，进行测评，结果见表6、图4。由表6和图4可知，120℃下炒制的两头尖色泽较好，质量佳，综合评分高，故选用120℃作为炒制温度。

表5 闷润时间考察结果Tab1e 5 Resu1ts of different stuffy times

表6 炒制温度考察结果Tab1e 6 Resu1tsof different stir-fried temperatures

图3 闷润时间考察结果Fig.3 Resu1ts of different stuffy time

3.2.4 炒制时间取净两头尖10份，各100g，每2份平行为1组。加入20%的食用醋拌匀，闷润2 h，120℃翻炒，分别炒制3、5、10、20、30、40min，炒制后取出，晾凉，进行测评，结果见表7、图5。由表7、图5可知，炒制10 min时效果最好，且节省能量，故确定炒制10 min。

图4 炒制温度考察结果Fig.4 Resu1ts of different stir-fried temperatures

表7 炒制时间的考察结果Tab1e 7 Resu1ts of different stir-fried times

图5 炒制时间的考察结果Fig.5 Resu1ts of different stir-fried times

3.3 正交试验结果

3个因素对试验结果的影响为A＞C＞B，A因素对试验结果影响显著，B、C因素对试验结果影响不显著；结合方差分析和直观分析结果，确定最佳炮制工艺为A1B3C1。正交试验结果见表8，方差分析见表9。

为进一步验证正交试验结果的准确性，按正交试验得出的两头尖最佳醋制工艺方法进行3批炮制试验，对其进行质量检查，以考察工艺的合理性。结果，最佳工艺所得饮片的外观性状、RDA含量及综合评价RSD＜3%均较为稳定，说明该工艺稳定、可行。

3.4 药理试验结果

3.4.1 两头尖及醋两头尖对小鼠的急性毒性试验给药后2 h内原药材的最大剂量组与1/2剂量组出现死亡，其他剂量组小鼠状态不佳，表现较为安静，活动减少，3～4d陆续出现死亡现象。醋制品组小鼠生理活性指标正常，活动减少，但无死亡现象。结果证明，两头尖具有急性毒性，其半数致死量LD50为52.56 g/kg，醋两头尖无急性毒性表现，说明两头尖经炮制后其毒性降低。

表8 正交试验结果Tab1e 8 Resu1ts of orthogona1 test

表9 方差分析结果Tab1e 9 Result of variance ana1ysis

3.4.2 两头尖及醋两头尖对弗氏完全佐剂所致大鼠足肿胀的影响由表10可知，0.5h后，模型组肿胀度明显增加，说明造模成功。4 h后各药物组的足跖肿胀度均明显降低，与模型组比较，醋两头尖组在给药2h时肿胀度与模型组有显著差异，且肿胀消除度远高于两头尖组，说明经炮制后的醋两头尖对足肿胀的治疗更有效。

表10 各组大鼠足肿胀度及抑制率Tab1e 10 Rat foot swelling and inhibition rates （,n=10）

注：与模型对照组比较，*.P＜0.05；**.P＜0.01Note:Compared with themode1 group,*.P＜0.05；**.P＜0.01

组别Group剂量（mg/kg）Dose肿胀度（mm）Swelling degree抑制率（%）Inhibition rate 0.5 h 1.0 h 2.0 h 3.0 h 4.0 h 6.0 h 0.5 h 1.0 h 2.0 h 3.0 h 4.0 h 6.0 h模型组Model group 0 7.83±0.75 8.51±0.63 8.63±0.36 8.41±0.42 7.93±0.36 7.25±0.35 0 0 0 0 0 0阳性药组Positive medicine group 5 6.88±0.85 7.56±0.54 7.62±0.46 6.65±0.63* 6.29±0.37** 5.11±0.63**12.1311.1611.7020.9320.6829.52两头尖组A.raddeana rhizoma group 300 7.31±0.37 7.54±0.85 6.90±0.37*6.43±0.31**6.09±0.69** 5.27±0.44** 6.64 11.4020.0423.5423.2027.31醋两头尖组Vinegar-prepared A.raddeana rhizomagroup 300 7.12±0.65 6.99±0.31 6.46±0.45*6.18±0.67**6.01±0.35** 4.79±0.46** 9.07 17.8625.1426.5224.2133.93

表11 各组大鼠血清IL-1、IL-6和TNF-含量Tab1e 11 Serum IL-1,IL-6 and TNF-content in rats （,n=10）

注：与模型组比较，*.P＜0.05；**.P＜0.01Note:Compared with themode1 group,*.P＜0.05；**.P＜0.01

组别 Group 剂量（mg/kg）Dose IL-1（pg/mL） IL-6（pg/mL） TNF-（pg/mL）模型组Model group - 150.59±9.85 143.87±11.66 145.61±5.12阳性药组Positive medicinegroup 5 55.31±6.33** 107.52±10.19** 93.02±6.17**两头尖组A.raddeanarhizoma group 300 97.94±12.32** 127.06±9.94* 108.14±5.49**醋两头尖组Vinegar-prepared A.raddeanar hizoma group 300 68.37±10.71** 117.98±10.53** 102.59±7.13**