栽培甘草的化学成分及其抗菌活性研究△

2019-07-03包芳白海英彭静文魏冠华王丽瑶邓庭伟王继永刘映前杨志刚

中国现代中药 2019年5期

包芳，白海英，彭静文，魏冠华，王丽瑶，邓庭伟，王继永，刘映前，杨志刚*

1.兰州大学药学院，甘肃兰州 730030；2.中国中药有限公司，北京 102600

甘草来源于豆科甘草属植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、光果甘草G.glabraL.和胀果甘草G.inflataBat.的根及根茎[1]。目前，栽培甘草已成为甘草商品的主要来源[2]，已从甘草中分离鉴定出400多种化学成分[3]。现代药理学研究表明，甘草具有保肝、抗炎、抗氧化、抗癌、抗肿瘤和抗菌等多种药理作用[4-5]。就抗菌活性而言，甘草不仅对人体致病菌有抑制活性，而且对农业植物病原菌也有抑制作用[6-7]。

本实验从栽培甘草中分离出14个化合物，分别鉴定为7-O-甲基羽扇豆异黄酮(7-O-methylluteone，1)、(R)-(-)-驴食草酚[(R)-(-)-vestitol，2]、红花岩黄芪香豆雌酚B(hedysarimcoumestan B，3)、山柰酚(kaempferol，4)、毛蕊异黄酮(calycosin，5)、甘草查尔酮B(licochalcone B，6)、7，2′，4′-三羟基-5-甲氧基-3-芳香豆素(7，2′，4′-trihydroxy-5-methoxy-3-arylcoumarin，7)、3，3′，4，4′-四羟基-2-甲氧基查尔酮(3，3′，4，4′-tetrahydroxy-2-methoxychalcone，8)、glycyrrhisoflavanone(9)、甘草素(liquiritigenin，10)、半甘草异黄酮B(semilicoisoflavone B，11)、isoangustone A(12)、粗毛甘草素C(glyasperin C，13)和白桦脂酸(betulinic acid，14)，并对化合物10～13进行了抗菌活性研究，旨在进一步合理利用甘草资源，开发安全、绿色和无污染的植物源杀菌剂。

1 仪器与材料

AVANCE AV III-400核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克公司)；超高效二维液相色谱仪-气相谱仪-四级杆飞行时间离子淌度质谱仪(美国安捷伦公司)；半制备型高效液相色谱仪(江苏汉邦科技有限公司)；制备型色谱柱(COSMOSIL-pack ODS 250 mm×10 mm，10 μm)；Sephadex LH-20(GE Healthcare公司)；薄层色谱硅胶GF254和柱色谱硅胶(200～300目，青岛海洋化工有限公司)；D(+)-无水葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)；琼脂(北京索莱宝科技有限公司)；所用试剂均为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)；植物病原菌菌种于甘肃省农业科学院选育。

甘草药材于2016年10月采自甘肃省武威市民勤县，经兰州大学药学院马志刚教授鉴定为甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎，标本(MQG201610)存放于兰州大学药学院生药学实验室。

2 提取与分离

称取甘草药材10 kg，经干燥、切碎后，用80%乙醇水浸泡3次，每次24 h，合并滤液，减压浓缩蒸馏得乙醇浸膏，加适量水混悬，分别用等体积的三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，得到三氯甲烷提取物142 g，乙酸乙酯提取物48 g，正丁醇提取物240 g。

取乙酸乙酯提取物46 g，用硅胶柱色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯(100∶1～0∶100)梯度洗脱，得到5部分(Fr.A～E)，Fr.B用开放ODS柱色谱(甲醇-水)梯度洗脱，得到14个部分(Fr.B1～14)，Fr.B13经硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇)梯度洗脱和半制备HPLC(75%甲醇水)纯化，得到化合物1(3.8 mg)和12(61.4 mg)。Fr.B12经硅胶柱色谱(三氯甲烷-丙酮)梯度洗脱和半制备HPLC(70%甲醇水)纯化，得到化合物10(25.0 mg)、11(28.0 mg)和13(15.0 mg)。Fr.B9依次通过硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇)梯度洗脱、Sephadex LH-20[三氯甲烷-甲醇(1∶1)]等度洗脱和制备型HPLC(65%甲醇水)纯化，得到化合物2(11.0 mg)、3(5.0 mg)和4(4.5 mg)。Fr.C经硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇)梯度洗脱分离，得到8个部分(Fr.C1～8)，Fr.C6依次经开放ODS柱色谱(甲醇-水)梯度洗脱和制备型HPLC(65%甲醇水)纯化，得到化合物6(10.0 mg)、7(9.0 mg)和8(8.0 mg)。Fr.C4依次经sephadex LH-20[三氯甲烷-甲醇(1∶1)]等度洗脱和制备型HPLC(70%甲醇水)纯化，得到化合物5(8.7 mg)和9(6.0 mg)。

取三氯甲烷提取物140 g用硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯(100∶1～0∶100)梯度洗脱，得到10个部分(Fr.1～10)，Fr.4通过硅胶柱色谱(石油醚-丙酮)梯度洗脱分离和重结晶得到化合物14(6.8 mg)。

3 结构与鉴定

化合物1：黄色粉末。分子式C21H20O6；ESI-MSm/z：369.132 6[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.24(1H，s，H-2)，6.72(1H，s，H-8)，6.37(1H，d，J=2.0 Hz，H-3′)，6.27(1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H-5′)，6.97(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，3.25(2H，d，J=6.8 Hz，H-1″)，5.13(1H，t，J=6.8 Hz，H-2″)，1.72(3H，s，H-4″)，1.61(3H，s，H-5″)，3.91(3H，s，7-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴定化合物1为7-O-甲基羽扇豆异黄酮。

化合物2：黄色粉末。分子式C16H16O4；ESI-MSm/z：273.111 4[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.85(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，6.28(1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H-6)，6.18(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.41(1H，d，J=2.0 Hz，H-3′)，6.34(1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-5′)，6.97(1H，d，J=8.0 Hz，H-6′)，4.13(1H，ddd，J=2.0，3.2，10.4 Hz，Heq-2)，3.90(1H，dd，J=10.4，10.4 Hz，Hax-2)，3.68(3H，s，4′-OCH3)，3.32(1H，ddd，J=11.2，10.4，3.0 Hz，Hax-3)，2.87(1H，dd，J=15.6，11.2 Hz，Hax-4)，2.71(1H，dd，J=15.6，3.6 Hz，Heq-4)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：29.7(C-4)，31.1(C-3)，54.8(4′-OCH3)，69.2(C-2)，101.3(C-3′)，102.5(C-8)，104.3(C-5′)，107.9(C-6)，112.7(C-10)，119.7(C-1′)，127.7(C-6′)，130.0(C-5)，154.6(C-9)，155.8(C-2′)156.4(C-7)，158.8(C-4′)。以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴定化合物2为(R)-(-)-驴食草酚。

化合物3：黄色粉末。分子式C16H10O6；ESI-MSm/z：299.054 6[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.68(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，7.12(1H，s，H-3′)，6.93(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.50(1H，s，H-8)，6.50(1H，s，H-6)，3.97(3H，s，4-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：155.5(C-5)，96.3(C-6)，95.9(C-8)，155.8(C-9)，156.7(C-2)，101.1(C-3)，114.3(C-1′)，120.3(C-6′)，113.9(C-5′)，157.5(C-4′)，98.5(C-3′)，156.7(C-2′)，159.3(C-4)，95.9(C-10)，56.4(4-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[10]，故鉴定化合物3为红花岩黄芪香豆雌酚B。

化合物4：黄色粉末。分子式C15H10O6；ESI-MSm/z：287.054 7[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.19(1H，br s，H-6)，6.43(1H，br s，H-8)，6.93(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，8.04(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，12.48(1H，s，5-OH)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：146.8(C-2)，135.7(C-3)，175.9(C-4)，160.7(C-5)，98.2(C-6)，164.1(C-7)，93.5(C-8)，156.2(C-9)，103.0(C-10)，121.7(C-1′)，129.5(C-2′)，115.4(C-3′)，159.2(C-4′)，115.4(C-5′)，129.5(C-6′)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物4为山柰酚。

化合物5：白色粉末。分子式C16H12O5；ESI-MSm/z：285.075 9[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.87(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.94(1H，dd，J=8.8，2.2 Hz，H-6)，7.97(1H，d，J=8.8 Hz，H-5)，7.01(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.93(1H，d，J=2.5 Hz，H-2′)，7.05(1H，dd，J=8.0，2.5 Hz，H-6′)，8.29(1H，s，H-2)，3.79(3H，s，4′-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：153.1(C-2)，124.7(C-3)，174.6(C-4)，127.3(C-5)，115.2(C-6)，162.6(C-7)，102.1(C-8)，157.4(C-9)，116.6(C-10)，123.4(C-1′)，112.0(C-2′)，146.0(C-3′)，147.5(C-4′)，116.5(C-5′)，119.7(C-6′)，55.7(4′-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物5为毛蕊异黄酮。

化合物6：棕黄色结晶。分子式C16H14O5；ESI-MSm/z：287.090 8[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：3.77(3H，s，2-OCH3)，7.33(1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，6.63(1H，d，J=7.6 Hz，H-5)，6.89(2H，d，J=6.0 Hz，H-3′，5′)，8.00(2H，d，J=7.6 Hz，H-2′，6′)，7.67(1H，d，J=15.6 Hz，H-α)，7.85(1H，d，J=15.6 Hz，H-β)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：138.4(C-β)，119.1(C-α)，187.3(C=O)，115.4(C-3′，5′)，162.0(C-4′)，130.9(C-2′，6′)，129.6(C-1′)，119.5(C-1)，148.6(C-2)，138.3(C-3)，149.8(C-4)，111.8(C-5)，118.6(C-6)，60.8(2-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物6为甘草查尔酮B。

化合物7：黄色粉末。分子式C16H12O6；ESI-MSm/z：301.070 2[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.85(1H，s，H-4)，6.34(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.35(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.34(1H，d，J=2.4 Hz，H-3′)，6.25(1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H-5′)，7.06(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，3.85(3H，s，5-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：160.3(C-2)，136.1(C-4)，119.1(C-3)，156.8(C-5)，95.3(C-6)，161.7(C-7)，94.5(C-8)，155.4(C-9)，106.3(C-10)，113.6(C-1′)，156.0(C-2′)，102.5(C-3′)，158.3(C-4′)，102.7(C-5′)，131.5(C-6′)，56.1(5-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物7为7，2′，4′-三羟基-5-甲氧基-3-芳香豆素。

化合物8：黄色结晶。分子式C16H14O6；ESI-MSm/z：303.085 6[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：3.77(3H，s，2-OCH3)，7.29(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.63(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.85(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，7.48(1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6′)，7.54(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.62(1H，d，J=15.6 Hz，H-α)，7.80(1H，d，J=15.6 Hz，H-β)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：138.0(C-β)，119.2(C-α)，187.4(C=O)，130.1(C-1′)，121.7(C-6′)，115.3(C-2′)，115.2(C-5′)，145.5(C-3′)，150.7(C-4′)，119.6(C-1)，148.6(C-2)，138.4(C-3)，149.6(C-4)，111.8(C-5)，118.6(C-6)，60.8(2-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物8为3，3′，4，4′-四羟基-2-甲氧基查尔酮。

化合物9：白色粉末。分子式C21H20O6；ESI-MSm/z：369.132 7[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：1.34(2H，s，H-4″，5″)，3.57(1H，t，J=5.6 Hz，H-3)，4.48(2H，br d，J=5.6 Hz，H-2)，6.05(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，5.94(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.54(1H，d，J=1.6 Hz，H-2′)，6.41(1H，d，J=1.6 Hz，H-6′)，6.28(1H，d，J=10.0 Hz，H-1″)，5.69(1H，d，J=10.0 Hz，H-2″)；3.71(3H，s，5-OCH3)，13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：27.5(C-5″)，27.5(C-4″)，75.7(C-3″)，131.2(C-2″)，122.1(C-1″)，128.7(C-1′)，116.3(C-2′)，145.2(C-3′)，139.0(C-4′)，121.4(C-5′)，116.8(C-6′)，70.3(C-2)，51.3(C-3)，187.9(C-4)，162.6(C-5)，95.3(C-6)，164.3(C-7)，93.3(C-8)，164.1(C-9)，104.3(C-10)，55.6(5-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物9为glycyrrhisoflavanone。

化合物10：淡黄色粉末。分子式C15H12O4；ESI-MSm/z：257.080 2[M+H]+；1H-NMR[400 MHz，(CD3)2CO]δ：5.45(1H，dd，J=2.8，13.0 Hz，H-2)，3.06(1H，dd，J=13.0，17.0 Hz，H-3α)，2.68(1H，dd，J=2.8，17.0 Hz，H-3β)，7.74(1H，d，J=8.8 Hz，H-5)，6.58(1H，dd，J=2.4，8.8 Hz，H-6)，6.43(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，7.41(2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，6.90(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)；13C-NMR[100 MHz，(CD3)2CO]δ：79.7(C-2)，43.8(C-3)，189.8(C-4)，128.7(C-5)，110.4(C-6)，163.7(C-7)，102.9(C-8)，164.4(C-9)，114.4(C-10)，130.5(C-1′)，128.2(C-2′)，115.3(C-3′)，157.8(C-4′)，115.3(C-5′)，128.2(C-6′)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物10为甘草素。

化合物11：淡黄色粉末。分子式C20H16O6；ESI-MSm/z：353.102 0[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：8.18(1H，s，H-2)，6.28(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.41(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.83(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.01(1H，d，J=2.0 Hz，H-6′)，6.41(1H，d，J=9.6 Hz，H-1″)，5.76(1H，d，J=9.6 Hz，H-2″)，1.43(3H，s，H-4″)，1.43(3H，s，H-5″)；13C-NMR[100 MHz，(CD3)2CO]δ：153.7(C-2)，122.1(C-3)，180.6(C-4)，163.1(C-5)，99.0(C-6)，164.1(C-7)，93.6(C-8)，158.1(C-9)，105.3(C-10)，122.7(C-1′)，122.1(C-2′)，145.3(C-3′)，140.1(C-4′)，121.5(C-5′)，118.0(C-6′)，116.6(C-1″)，131.2(C-2″)，76.6(C-3″)，27.1(C-4″)，27.1(C-5″)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物11为半甘草异黄酮B。

化合物12：白色粉末。分子式C25H26O6；ESI-MSm/z：423.178 9[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.22(1H，s，H-2)，6.43(1H，s，H-8)，6.88(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.65(1H，d，J=2.0 Hz，H-6′)，5.16(1H，t，J=6.8 Hz，H-3″)，3.23(2H，d，J=6.4 Hz，H-1″)，1.61(3H，s，H-4″)，3.23(2H，d，J=6.4 Hz，H-1‴)，5.28(1H，t，J=6.8 Hz，H-3‴)，1.66(3H，s，H-4‴)，1.66(3H，s，H-5″)，1.71(3H，s，H-5‴)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：153.7(C-2)，121.1(C-3)，180.3(C-4)，158.8(C-5)，111.0(C-6)，161.9(C-7)，92.9(C-8)，155.3(C-9)，104.3(C-10)，123.1(C-1′)，120.5(C-2′)，144.5(C-3′)，143.1(C-4′)，128.0(C-5′)，114.0(C-6′)，21.0(C-1″)，122.5(C-2″)，130.9(C-3″)，17.7(C-4″)，25.5(C-5″)，28.3(C-1‴)，122.2(C-2‴)，131.7(C-3‴)，17.7(C-4‴)，25.6(C-5‴)。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物12为isoangustone A。

化合物13：黄色粉末。分子式C21H24O5；ESI-MSm/z：357.168 5[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.86(1H，d，J=8.0 Hz，H-6′)，6.32(1H，d，J=2.4 Hz，H-3′)，6.18(1H，dd，J=2.4，8.0 Hz，H-5′)，4.10(1H，brd，J=8.0 Hz，H-2)，3.86(1H，t，J=8.0 Hz，H-2)，3.20(3H，m，H-3)，2.69(1H，m，H-4)，3.14(1H，m，H-4)，6.08(1H，s，H-8)，3.42(2H，d，J=6.0 Hz，H-1″)，5.13(1H，t，J=6.0 Hz，H-2″)，1.69(3H，s，H-4″)，1.61(3H，s，H-5″)，3.60(3H，s，5-OCH3)，9.34(1H，s，OH)，9.15(1H，s，OH)，9.09(1H，s，OH)，13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：117.9(C-1′)，155.8(C-2′)，102.5(C-3′)，156.8(C-4′)，106.2(C-5′)，127.5(C-6′)，69.1(C-2)，30.7(C-3)，25.5(C-4)，156.8(C-5)，113.1(C-6)，154.4(C-7)，98.6(C-8)，152.9(C-9)，106.7(C-10)，22.3(C-1″)，124.2(C-2″)，129.2(C-3″)，17.7(C-4″)，25.4(C-5″)，59.9(5-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[19]，故鉴定化合物13为粗毛甘草素C。

化合物14：白色粉末。分子式C30H48O3；ESI-MSm/z：455.354 1[M-H]﹣；1H-NMR(400 MHz，pyridine-d5)δ：0.80(3H，s，H-25)，0.99(3H，s，H-27)，1.04(3H，s，H-24)，1.05(3H，s，H-26)，1.20(3H，s，H-23)，1.77(3H，s，H-30)，2.23(1H，m)，2.62(2H，dt，J=9.2，3.2 Hz，H-19)，2.72(1H，td，J=2.4，11.2 Hz，H-6)，3.43(1H，t，J=8.0 Hz)，3.53(1H，m)，4.75(1H，s，H-29)，4.92(1H，d，J=2.4 Hz，H-29)；13C-NMR(100 MHz，pyridine-d5)δ：39.3(C-1)，28.4(C-2)，78.1(C-3)，39.5(C-4)，55.9(C-5)，18.5(C-6)，34.5(C-7)，41.1(C-8)，51.0(C-9)，37.6(C-10)，21.4(C-11)，26.0(C-12)，39.0(C-13)，42.8(C-14)，31.4(C-15)，32.8(C-16)，56.6(C-17)，47.9(C-18)，50.1(C-19)，151.4(C-20)，30.5(C-21)，37.5(C-22)，28.6(C-23)，16.3(C-24)，16.4(C-25)，16.6(C-26)，14.9(C-27)，178.8(C-28)，110.0(C-29)，19.5(C-30)。以上数据与文献报道基本一致[20]，故鉴定化合物14为白桦脂酸。

4 抗菌活性筛选

本实验采用菌丝生长速率法。称取待测化合物溶解于适量二甲基亚砜(DMSO)中，将其加入无菌PDA培养基使化合物浓度为100 μg·mL-1，以DMSO为空白对照。待培养基冷却后，从活化后的菌种中取菌饼(d=5 mm)并接种于培养基，置于(25±1)℃环境恒温培养，待对照菌丝生长至培养皿约2/3，取出测量菌丝生长直径(mm)。每个处理设3次重复，计算平均抑制率，菌丝生长抑制率按公式(1)计算。

菌丝生长抑制率=

(1)

数据处理用Excel办公软件，数据分析使用SPSS19.0统计软件，用Duncan法进行多重比较，结果见表1。实验结果显示，半甘草异黄酮B(11)和粗毛甘草素C(13)在100 μg·mL-1质量浓度下，对农业菌具有较高的抑制率，尤其对立枯丝核菌抑制效果最好，这为研发新型农药提供了基础理论依据。