臭氧急性暴露对大鼠血管的损伤及其机制*

杨 虎， 李 宁， 韩 洁,3， 朱晨丽， 田 蕾， 林本成， 袭著革， 刘晓华,3△， 初 楠△

(1. 大连大学附属中山医院， 辽宁 大连 116001； 2. 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所， 天津 300050； 3. 天津体育学院， 天津 301617)

随着我国经济的飞速发展，空气污染问题日益突出。除了广泛关注的固态颗粒物(particulate matter，PM)外，臭氧 (O3)越来越成为夏季重要的环境污染物，臭氧与人群健康的关系也逐步受到重视，已成为研究的热点。臭氧是一种强氧化性的气体，一方面可与直接接触的人体组织(呼吸道、肺、角膜等)产生强烈的氧化效应，导致组织损伤[1]；另一方面，可通过与肺泡液及肺泡上皮细胞反应生成氧化产物(醛类，羧酸和过氧化氢)，产物随后进入血液循环，对机体产生更广泛的损伤[2]。血管在机体内参与多种生理生化过程，包括物质运输、维持调节血压、参与凝血及抗凝反应，炎症反应以及内分泌功能。血管损伤是动脉粥样硬化形成、血栓性疾病的重要原因。流行病学研究已显示臭氧暴露会增加心血管疾病死亡率。在中国，大气臭氧浓度每增加10 μg/m3，人群中心血管疾病死亡率增加 0.448% (95% CI 0.171%,0.724%)[3, 4]。进一步研究发现，短期臭氧暴露导致心血管死亡率增加的可能机制是血压升高和血小板活化[5]，或者通过颗粒物来间接介导损伤[6]。而Xie等[7]研究发现，大鼠腹腔注射的臭氧可以导致炎症因子和血管内皮生长因子升高，这提示臭氧可以导致炎症并促进血管内皮增生。Miller等[8]的研究发现，臭氧暴露后可增加胚胎植入后的 Long-Evans大鼠子宫动脉血流阻力增加。Micheal等[9]的实验发现臭氧0.8 ppm持续24 h急性暴露后，SD大鼠离体冠脉血管对乙酰胆碱碱的逆收缩反应降低。目前有关臭氧单因素多浓度急性暴露对血管损伤和机制的研究尚未见报道，因此，本研究选择不同浓度臭氧建立大鼠急性暴露模型，观察其对血管的结构与功能，对血液中多种生化、代谢指标，以及氧化应激和炎症反应等的影响，明确臭氧急性暴露对血管的损伤效应，并探讨可能的作用机制，为防治臭氧暴露导致的心血管系统损伤提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

气体染毒柜(HRH CSED-K，北京慧荣和)，臭氧发生器(FW-120，Vonti，中国)，臭氧监测仪(1003 AH，CA，Glendale)，医学生理信号采集系统(PClab-UE，北京微信斯达科技有限公司)，冷冻离心机(TGL-20M，湘仪)，连续可见光谱酶标仪(xMark Microplate Spectrophotometer，Bio-Rad)，液相芯片仪(Luminex200，德国Merk公司)，血生化分析仪(C501，罗氏)，血流变分析仪(ZL6000，众驰伟业)；Wistar大鼠(北京维通利华实验动物有限公司)，大鼠内皮素1(endothelin-1, ET-1)、血管性血友病因子(von willebrand factor, vWF)、同型半胱氨酸(hemocysteine, HCY)、白介素6(interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)检测试剂盒酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(北京博奥拓达)，丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、一氧化氮(nitric oxide, NO)检测试剂盒(南京建成生物科技公司)。10%甲醛固定液、无水乙醇、二甲苯和苏木素-伊红(HE)染液(Solarbio公司)。

1.2 动物分组与处理

健康雄性Wistar大鼠120只，体重175～200 g，随机分为6组，每组20只，饲养环境为温度(21±1)℃，湿度50%±5%，12 h的光照/黑夜循环。适应性喂养5 d后，将大鼠放入气体染毒柜中，对照组暴露于过滤后空气，处理组分别暴露于浓度为0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm和4.0 ppm的臭氧，持续4 h。暴露期间气体染毒柜中的温度保持在22.6～25.6℃，湿度保持在35%～65%。暴露结束后，每组取10只大鼠，称重后，用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，待夹趾反射消失后，行右侧颈总动脉插管术，压力导管经肝素钠抗凝，通过PC-lab医学生理信号采集系统采集血压信号，测量颈动脉血压变化曲线数据。剩余10只经麻醉后，腹主动脉取血，留取血液样本。随后，剪取5只大鼠胸主动脉组织置于10%甲醛固定液固定，用于制备大鼠主动脉石蜡切片。

1.3 血液生化指标检测

大鼠麻醉后腹主动脉取血，用5 ml肝素抗凝管和5 ml含分离胶的促凝管分别采集全血和血清。全血及部分血清样本送天津迪安诊断实验室检测血流变和血液生化指标，另一部分血清分装后于-80℃冰箱冻存，用于其他指标检测。

1.4 血管功能损伤指标检测

通过检测血清中ET-1、HCY、vWF和NO含量评价血管损伤。血清中ET-1、HCY和vWF含量依照试剂盒说明书，采用ELISA微孔板法检测。血清中NO含量依照试剂盒说明书，采用微孔板比色法检测。

1.5 氧化应激指标检测

通过检测血清中SOD、MDA、GSH和8-OHdG含量来评价大鼠的氧化应激状态。SOD和MDA分别采用黄嘌呤氧化酶法和TBA法测定，GSH采用微孔板比色法，8-OHdG采用ELISA微孔板法检测。测试过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 炎症反应指标检测

通过检测大鼠血清炎症因子(TNF-α、IL-6)含量来评价大鼠的免疫反应，血清中TNF-α和IL-6含量依照试剂盒说明书，采用ELISA微孔板法检测。

1.7 大鼠主动脉病理变化

取甲醛固定后的胸主动脉组织中段，经梯度乙醇逐级脱水15 min，再经二甲苯逐级10 min透明，I级蜡10 min、Ⅱ级蜡30 min Ⅲ级蜡45 min逐级浸蜡、石蜡包埋后切片，片厚5 μm，置37℃烤箱中烤片，石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇5 min逐级复水，后进行HE(苏木素-伊红)染色，再经脱水、透明后，用中性树胶封片，分别取每组5只大鼠胸主动脉组织光镜下观察组织结构形态改变，拍照。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 臭氧急性暴露对大鼠颈动脉血压的影响

结果表明，臭氧暴露后0.12 ppm与对照组相比动脉最大收缩压显著升高(P<0.05)，但随着暴露浓度继续增加逐渐呈降低的趋势。平均血压和最大动脉收缩压趋势一致，但变化无统计差异，平均舒张压脉压随暴露浓度的增大呈现先降低后升高的趋势，而收缩和舒张间期变化趋势类似，呈现低浓度升高，高浓度降低的趋势，尽管与对照组相比无统计学差异，但反应出臭氧急性暴露可导致心率增快(表1)。

2.2 臭氧急性暴露与血液流变学的改变

结果表明，臭氧暴露后， 2.0 ppm组与对照组相比全血粘度1/S显著升高(P<0.05)，各暴露组血浆粘度均显著升高(P<0.01，P<0.01，P<0.05，P< 0.01，P<0.01)，1.0 ppm组与对照组相比血沉方程K值显著升高(P<0.05)，全血高切还原粘度和相对指数变化趋势类似，臭氧浓度0.5 ppm组和4.0 ppm组与对照组相比显著降低(P<0.05，P<0.01，表2)。

2.3 臭氧急性暴露对血液生化指标的影响

结果表明，总胆固醇在臭氧暴露后下降，臭氧浓度为0.12 ppm，0.5 ppm，1.0 ppm，4.0 ppm组与对照组相比总胆固醇均显著下降(P<0.01，P<0.05，P<0.05，P<0.05)；高密度脂蛋白胆固醇下降趋势幅度和总胆固醇相似， 其中0.12 ppm组与对照组相比显著下降(P<0.01)。非高密度脂蛋白胆固醇(non-HDL-C)有下降趋势。急性臭氧暴露后血糖(GLU)、电解质(K+，Na+，Cl-)和血肌酐(CREA)随暴露浓度的增大变化不显著(表3)。

2.4 臭氧急性暴露与血清炎性因子水平的变化

臭氧暴露后血清中炎症因子的结果表明，暴露浓度为1.0 ppm组和4.0 ppm组与对照组相比TNF-α均显著升高(P<0.05，P<0.05)。IL-6略下降，但无统计差异(表4)。

2.5 臭氧急性暴露对氧化应激的影响

结果表明，臭氧暴露较高浓度组2.0 ppm和 4.0 ppm与对照组相比血清中GSH时显著下降(P< 0.05，P<0.01，表5)，而在臭氧浓度1.0 ppm组和2.0 ppm组与对照组相比MDA显著升高(P< 0.05，P<0.05，表5)。8-OHdG和SOD活力变化无统计学差异(表5)。

2.6 臭氧急性暴露对血管结构和功能的影响

结果表明，4.0 ppm组与对照组相比ET-1显著升高(P<0.05)，而臭氧浓度1.0 ppm组与对照组相比大鼠血清HCY显著升高(P<0.05)，vWF和一氧化氮变化不显著。并且，臭氧急性暴露后大鼠血管主动脉石蜡切片经HE染色后观察未发现明显的血管内皮及血管壁病理改变(未附图)。

Tab. 1 Blood pressure changes after acute exposure to ozone in n=10)

*P<0.05vs0 ppm group

Tab. 2 Changes in blood rheology after ozone n=10)

*P<0.05,**P<0.01vs0 ppm group

Tab. 3 Changes of blood lipid l indicators after acute ozone exposure(mmol/L, n=10)

TG: Triglyceride; TC: Total cholesterol; HDL-C: High density lipoprotein cholesterol; LDL-C: Low density lipoprotein cholesterol; non-HDL-C: non-High density lipoprotein cholesterol; CREA: Creatinine

*P<0.05,**P<0.01vs0 ppm group

Tab. 4 Inflammatory factors changes after acute exposure to ozone in rats(pg/ml, n=10)

TNF-α: Tumor necrosis factor alpha level; IL-6: Interleukin -6 level

*P<0.05vs0 ppm group

Tab. 5 Oxidative stress changes after acute exposure to ozone in n=10)

GSH: Glutathione; MDA: Malondialdehyde; 8OHdG: 8-hydroxydeoxyguanosine

*P<0.05，**P<0.01vs0 ppm group

Tab. 6 Vascular endothelial injury of rats after acute exposure to ozone in n=10)

ET-1: Endothelin-1; HCY: Homocysteine; NO: Nitric oxide; vWF: von Willebrand factor

*P<0.05vs0 ppm group

3 讨论

已有研究提示，臭氧可以通过直接或间接途径导致机体的损伤。鉴于血管在循环系统疾病发生发展中的重要作用，本研究系统地探讨了臭氧急性暴露对血管的损伤效应，以及对相关因素的影响。

首先，本文检测了臭氧急性暴露对血管结构和功能的影响。虽然未观察到血管结构变化，但是血管损伤标志ET-1在臭氧暴露后显著升高。ET-1是血管内皮损伤后分泌的一种强效血管收缩剂，对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用，在体内外实验均能刺激心肌细胞肥大[10]，引起血管平滑肌产生MCP-1，趋化单核细胞浸润[11]。同时较高浓度臭氧暴露后血清中HCY升高，HCY是人体内含硫氨基酸的重要中间代谢产物，同型半胱氨酸被认为是动脉粥样硬化的独立危险因素[12]，提示可能影响含硫氨基酸代谢，HCY可以使血管舒缩功能减退[13]，长期暴露可能导致H型高血压。臭氧暴露后的HCY及ET-1的升高对于那些对心脏后负荷敏感的心衰和冠心病病人是一个不利因素[14]。

其次本文为了探讨不同浓度臭氧急性暴露对血管影响的可能机制，对与血管相关的生理、生化指标进行了检测。低浓度臭氧(0.12 ppm)急性暴露可导致动脉收缩压升高，而此浓度下血清ET-1水平并未显著升高，动脉收缩和舒张间期在臭氧暴露后随浓度增加呈现先升高后降低的趋势，提示臭氧导致交感神经兴奋。这些结果与Barath[15]等人的研究结果相一致，即臭氧暴露导致血管对舒血管物质反应敏感性升高，神经调节机制参与血压调节并起到决定性作用。

血液流变学及血液生化指标结果显示，血浆粘度增加，红细胞变形指数也增加，TC及HDL-C降低，且趋势和幅度一致。这提示臭氧暴露可以导致血流变学改变，可能与应激反应、代谢产物增加或者炎症物质释放激活血小板有关。低浓度的臭氧暴露即可引起血浆粘度升高，对于动脉粥样硬化患者特别是冠心病不稳定斑块患者是一个危险因素。HDL-C降低与心血管疾病的发病率呈负相关[16, 17]，对心血管疾病为保护因素，其降低可能臭氧急性暴露损伤引起的应激反应有关。Tham[18]等进行转录组学的研究结果提示，臭氧暴露可能与胆固醇代谢障碍相关，血脂对血管壁的影响较缓慢，所以亚慢性或者慢性臭氧暴露对于HDL-C的影响有待进一步研究。

血清中氧化应激和炎症反应状态结果显示，臭氧暴露后血清中GSH降低，高浓度组降低更显著，而MDA含量升高，提示臭氧暴露导致机体抗氧化调节的紊乱，可进一步导致血管内皮损伤。Raghavan[19]的研究表明，MDA可通过诱导炎症途径和网络促进淋巴细胞活化，MDA的升高是炎症反应增强的诱因。臭氧暴露后血清中炎症因子TNF-α显著升高。TNF-α的释放增加，可使巨噬细胞游走活化增强[20]，使炎症损伤范围加大和强度加重，系统炎症反应和巨噬细胞进入血管内皮下是动脉粥样硬化斑块形成的条件之一，也是不稳定斑块破裂的可能原因之一。本研究发现，高浓度臭氧暴露时炎症反应明显增强，但低浓度暴露时改变不明显。Henriquez等[21]利用肾上腺素能和糖皮质激素受体拮抗剂可减少臭氧诱导的肺损伤和炎症，这对于我们进行下一步探讨防治臭氧导致的心血管损伤措施提供了参考。

综上所述，臭氧急性暴露可影响大鼠的动脉血压、血流变及胆固醇代谢，导致血管内皮损伤，其损伤的机制可能与神经调节紊乱、诱发氧化应激反应和系统炎症有关。