树形分子在siRNA递送载体中的应用

蔡龚莉，陈 裕，林舒婷，朱丹丹，董怡文，李 宁，刘潇璇*

(中国药科大学 1天然药物活性组分与药效国家重点实验室；2药物科学研究院高端药物制剂与材料研究中心，南京 210009)

RNA干扰(RNA interference,RNAi)在1998年由Fire等[1]首次报道，它是一种由小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)触发的特异性基因沉默效应。在RNAi过程中，双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子被RNase-Ⅲ类核酸内切酶Dicer切割成21～23个核苷酸的双链siRNA，该双链siRNA和Argonaute 2(Ago2)蛋白、核酸内切酶Dicer、解旋酶结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)，双链解开，其中正义链被降解，反义链保留并激活RISC。当反义链通过Watson-Crick碱基互补配对原则与特定的靶mRNA结合时，mRNA被RISC中的Dicer切割后降解，无法进一步翻译成蛋白质并导致基因沉默。此外，RNAi具有级联放大效应，在mRNA降解后，活化的RISC再参与另一个mRNA降解循环[2](图1)。基于此，研究人员设计特定序列的siRNA用于特异性沉默致病基因，从而达到治疗的目的。2018年美国食品药品监督管理局批准了首款siRNA药物patisiran(Onpattro®)用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性(hATTR)引起的周围多发性神经疾病(polyneuropathy)，与此同时还有多种siRNA药物正在进行临床试验[3]。基于siRNA的RNAi疗法具有很多优点，比如良好的安全性、特异性和高效性。但siRNA分子本身的一些特点，如血浆半衰期短、易被核酶降解、易被肾脏清除、带负电荷难以自发穿过细胞膜等，使其具有较差的成药性。因此，提高siRNA成药性的关键在于发展安全高效的siRNA递送系统。

目前常用的siRNA递送载体可分为病毒类载体和非病毒类载体。病毒载体具有很高的转染效率，但是自身的安全性不佳，如有免疫原性等，且生产成本高昂，限制了其临床应用[4]。相比之下，非病毒载体具有低免疫原性、低生产成本和低毒性等优点，吸引了研究人员的广泛关注。这些非病毒载体主要分为阳离子脂质和阳离子聚合物两大类。阳离子载体通过静电相互作用结合siRNA形成稳定纳米粒，保护siRNA在体循环过程中不被降解，将其递送至靶向部位，促进细胞摄取，并在siRNA/载体复合物内化后，通过内涵体逃逸并有效将siRNA释放到细胞质中，参与RNAi过程，产生有效的基因沉默效应(图2)。

Figure 1Mechanism of RNA interference

Figure 2Non-viral vectors mediated siRNA delivery

在众多siRNA递送系统中，树形分子作为聚合物载体家族中特殊的一员，因其独特的结构和性质引起研究人员的广泛关注[5]。树形分子概念在20世纪80年代被首次提出，其英文名(dendrimer)来源于希腊语“dendron”(tree的意思)和“meros”(part的意思)。树形分子是一类球状纳米级大分子，其结构通常可以分为3个部分：中心核、分支单元和末端基团[6]。中心核位于树形分子的最里层。分支单元(重复单元)在中心核和分子表面之间，是由核出发经过重复的反应得到的一系列径向分布的同心层，每一层叫做树形分子的一代(Generation,G)。分支单元有着精确的结构，作为树形分子的骨架参与其三维结构的变化。末端基团处于树形分子表面，可经修饰后实现不同的用途，在基因或药物递送时起着关键的作用(图3)。

Figure 3Dendrimer structure

树形分子一般通过发散法、收敛法或发散收敛法合成[5](图4)。发散法是指从树形分子的中心核出发，通过与分支单元的重复反应，逐步增加分子大小和代数。这种方法的缺陷在于随着树形分子代数的增长，由于表面的空间位阻效应使得反应难以进行完全，导致产生含有缺陷的副产物分子，这种缺陷会随着代数积累而且产物难以纯化。为了确保反应的进行和防止副产物的生成，往往需要加入过量的反应物，但这又会增加纯化难度。与之相对的收敛法则是指从树形分子结构的表面出发，通过与分支单元逐步反应，形成树状单元，再将树状单元与树形分子的中心核连接形成完整的树形分子。这种方法跟发散方法相比反应易于控制，副产物容易分离，能有效降低产物的结构缺陷，可以得到较为完整的分子，但同样由于空间位阻效应很难得到高代分子。而发散收敛法是通过发散法合成树形分子的中心核，然后通过收敛法合成树状单元，再将中心核与树状单元连接得到完整的树形分子。这种方法结合发散和收敛两种合成方法优点，可以缩短合成高代树形分子的时间，同时这种方法还可以通过可控的方式将不同的树状单元结合到一起，从而得到具有特殊用途的非对称树形结构。

Figure 4Strategies of dendrimer synthesis

A:Divergent approach;B:Convergent approach;C:Double-stage convergent approach

树形分子具有一些独特的物理化学性质[6]，例如具有精确的结构，良好的单分散性；同时，树形分子表面具有大量的末端基团，可以与溶剂或其他分子发生多位点的相互作用，使得树形分子具有较好的溶解性和反应活性；此外，树形分子的末端基团还可以进行多种修饰，赋予树形分子不同的性质，例如修饰特异性配体可以增强树形分子的靶向递送能力。

目前树形分子在siRNA递送领域的应用日益增多[7]，聚酰胺-胺类[poly(amidoamine)，PAMAM]、聚丙烯亚胺类[poly(prophylenimine)，PPI]、肽类(peptide dendrimer)、聚甘油类(polyglycerol dendrimer，PG)、碳硅烷类(carbosilane dendrimer，CBD)、三嗪类(triazine dendrimer)、两亲类(amphiphilic dendrimer)等多种树形分子被开发用于递送siRNA，其中PAMAM是目前研究得最深入和最广泛的一类。本文将对以上不同类别的树形分子在siRNA递送方面的应用进行综述。

1 聚酰胺-胺类树形分子(PAMAM)

在众多树形分子载体中，聚酰胺-胺类树形分子是研究得最早和最深入的一类。Tomalia等[8]在1985年首次合成了PAMAM树形分子(图5-A)，传统的PAMAM树形分子以氨为核，通过与丙烯酸甲酯的Michael加成和与乙二胺的酰胺化交替反应合成。在PAMAM树形分子递送siRNA的过程中，阳离子PAMAM树形分子表面大量的胺基基团可以通过静电相互作用结合siRNA并形成稳定纳米粒，从而有效保护siRNA，避免其被核酶降解。然后，siRNA/树形分子复合物纳米粒经内吞途径被细胞摄取，被内化的纳米粒主要聚集在酸性细胞器中，如内涵体和溶酶体。树形分子结构中存在大量叔胺基团，使其具备很强的pH缓冲能力，可通过“质子海绵”效应实现内涵体逃逸，从而促进siRNA的释放，达到基因沉默效果[9]。

研究表明，相比于完整结构的树形分子，部分降解的树形分子具有更高的基因递送效率[10]。2005年Kang等[11]尝试通过结构完整的G5PAMAM树形分子来递送siRNA，但并没有观察到基因沉默效果，他们猜测是siRNA在胞内的不完全释放导致的。而基于PAMAM树形分子的商业转染试剂PolyFect®和SuperFect®的活性成分是部分降解的PAMAM树形分子，可能是因为部分降解的树形分子具有更开放和柔顺的结构，使其更易于与核酸和水分子作用，有利于核酸的结合和释放。这些部分降解的PAMAM树形分子通常是将结构完整的树形分子进行碱水解或热降解的方法得到[10]。众所周知，高代树形分子(如G5)的合成和纯化过程都相当耗时耗力，通过合成完整的高代树形分子再进行降解得到部分降解的产物用于高效的基因递送，是一种不经济又不环保的方法。因此，在2006年，Zhou等[12]就报道了以三乙醇胺(TEA)为核的一类具有柔顺结构的PAMAM树形分子(图5-B)，与传统氨为核的PAMAM树形分子相比，这种具有开放和柔顺结构的树形分子的空间位阻较低，利于其与siRNA的结合，同时水分子也更容易进入树形分子内部，增加内部叔胺质子化的可能，促进siRNA 借助“质子海绵”效应的释放。实验证明，该结构柔顺型树形分子能够和siRNA结合形成大小约为70 nm的稳定纳米粒，保护siRNA并促进其细胞摄取[13]。在前列腺肿瘤细胞模型[13]中，这类结构柔顺的PAMAM树形分子在其代数等于或高于5时都能有效递送siRNA，降低热休克蛋白27(Hsp27)的表达并产生Caspase依赖的抗肿瘤活性。此外，这类树形分子还能有效地将siRNA递送到人类T细胞和原代PBMC细胞中，并产生显著的基因沉默效应[14]。同时，该树形分子能够在人源化小鼠艾滋病模型中进行系统给药，递送可以同时靶向艾滋病毒复制和感染的siRNA并发挥基因沉默效应，有效预防宿主CD4+T细胞耗竭和病毒逃逸，产生显著抗HIV活性[14]。最新研究表明，该类树形分子还可将siRNA靶向递送至卵巢癌干细胞，显著抑制卵巢癌干细胞的扩张、黏连、侵袭转移和肿瘤的生长[15]。除了上述的前列腺癌，艾滋病和卵巢癌疾病模型，这类新型结构柔顺的树形分子介导的小RNA治疗还成功地应用于肝癌[16]、胶质瘤[17]等疾病模型中。

PAMAM树形分子表面具有丰富的末端基团，围绕其末端基团可以进行多种修饰，这些修饰可以降低siRNA/树形分子复合物在递送过程中的毒性、提高其靶向性、增加细胞摄取等。

阳离子树形分子经部分修饰后可有效降低其细胞毒性。高代PAMAM树形分子携带较多的表面正电荷，具有较高的转染效率，同时过多的正电荷会增加纳米复合物的细胞毒性，因此可以通过对其正电荷表面进行一定程度的修饰，在保持其递送活性的同时降低其细胞毒性。例如聚乙二醇(PEG)作为在改善阳离子载体细胞毒性中被开发最多的聚合物，能够极大地降低阳离子树形分子的细胞毒性。在G5或G6PAMAM上进行8%的PEG修饰(图6-A)[18]可以提高转染效率、降低毒性，其递送siRNA产生的基因沉默效应要远优于未修饰的树形分子，与商业转染试剂Lipofectamine 2000(Lipo)效果相当。

Figure 5PAMAM dendrimers

A:Amine (NH3) core PAMAM dendrimer;B:Triethanolamine (TEA) core PAMAM dendrimer

在树形分子表面进行特定修饰可以实现siRNA的靶向递送，有效减少非特异性递送，提高递送效率并降低毒性。透明质酸是一种天然的具有细胞特异性的聚合物，其受体CD44在MCF-7和MDA-MB-231等细胞系中高度表达，使用透明质酸修饰树形分子可以通过靶向效应增加siRNA在相应肿瘤细胞中的递送效率。Ma等[19]通过修饰透明质酸四糖簇的G4PAMAM树形分子实现siRNA的成功递送(图6-E)。与透明质酸寡糖相比，透明质酸四糖簇与受体CD44的结合能力增强，修饰后的树形分子与siRNA形成复合物，并进一步通过CD44介导的胞吞作用大大增加其细胞摄取，从而发挥显著的基因沉默效应。除此之外，一些靶向肽和某些肿瘤细胞高表达的受体之间存在着特异性相互作用，也常用于修饰树形分子末端以促进siRNA/树形分子复合物的靶向递送。如Liu等[20]将双靶向肽RGDK引入到结构柔顺型PAMAM树形分子的siRNA递送系统中，其中RGD可以通过与肿瘤血管上过表达的ανβ3整合素的相互作用靶向肿瘤内皮细胞，增加siRNA/树形分子复合物在肿瘤部位的富集，减少非特异性递送；RGDK则可与肿瘤细胞表面的Nrp-1受体结合，增加细胞摄取。

对树形分子表面进行特定的修饰还可以提高细胞对复合物的摄取，从而提高siRNA的基因沉默效率。众所周知，含有丰富精氨酸的细胞穿透肽能够促进细胞摄取，因为在生理条件下，每个精氨酸残基都含有一个带正电荷的胍基，胍基可以通过其平面结构与细胞膜相互作用，从而促进膜的渗透。因此，将精氨酸修饰于树形分子的末端(图6-B)[21]，能够增强树形分子与siRNA的相互作用，促进细胞摄取，提高转染效率。在树形分子上进行脂质修饰是另一种增加摄取的方法。脂质修饰后可以平衡树形分子的阳离子电荷和脂质含量，促进纳米粒的细胞摄取和内涵体逃逸，进而优化siRNA递送及转染效率。C12饱和烷基链修饰的PAMAM(图6-C)[22]介导的siRNA的递送中，即使在低siRNA剂量(10 nmol/L)下，也具有80%的基因沉默效果。同时，脂质修饰后的树形分子还可以实现抗肿瘤药物和siRNA共同递送治疗多药耐药。Biswas等[23]将1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(DOPE-PEG)连在PAMAM树形分子上所得的共聚物能够自组装成尺寸低于100 nm的胶束，其对阿霉素和siRNA的递送能力都有了极大的提高。除了细胞渗透肽和脂质之外，全氟烷基化合物因其独特的性质也常被用于修饰树形分子以提高递送效率。含氟化合物既疏水又疏脂，同时存在独特的氟氟相互作用，有利于siRNA/树形分子复合物在低N/P比条件下实现最佳的转染效果，提高其血清稳定性，增加细胞摄取，促进内涵体逃逸。He等[24]在不同代数PAMAM树形分子上缀合双尾氟化合物2-氯-4,6-双[(全氟己基)丙氧基]-1,3,5-三嗪(CBT)显示出高siRNA递送功效，并且所修饰的树形分子在其最佳转染条件下表现出最低的细胞毒性。Wang等[25]合成的七氟丁酸修饰的PAMAM也表现出优异的siRNA递送能力(图6-D)，在低剂量条件下其基因沉默效应甚至优于商业转染试剂Lipo。

2 聚丙烯亚胺类树形分子(PPI)

聚丙烯亚胺类树形分子是另一类常用的树形分子(图7)。它主要以胺为起始原料，通过与丙烯腈的Michael加成、腈基还原成氨基两步反应的交替进行得到。Buhleier等[26]在1978年首次报道了PPI的合成，但存在反应不完全、副反应多、产率低等问题。在此基础上，研究人员优化了PPI的制备方法[27-28]，在胺和丙烯腈的Michael加成反应中加入水，使得过量的丙烯腈能够与水形成共沸物并除去，腈基末端的化合物可经水洗涤纯化得到；随后，使用Raney/Cobalt对腈基进行加氢还原，过滤后得到纯产物。优化后的制备方法显著降低了产物的纯化难度、减少了副反应、提高了产率，可应用于大量生产。PPI结构中含有大量胺基基团，包括末端的伯胺和内部的叔胺，因此也适用于siRNA的递送。为了提高PPI的递送效率和靶向能力，研究人员常常在PPI结构中修饰靶向基团，期望通过受体-配体的特异性识别，以提高靶向递送能力。Tietze 等[29]开发了基于麦芽糖修饰的PPI树形分子的载体系统，其中，载体中的单抗片段可靶向识别肿瘤细胞过表达的表皮生长因子受体Ⅲ(EGFRvIII)，实现siRNA的高效靶向递送。此外，促黄体激素释放激素(LHRH)也常用于修饰PPI以提高载体的靶向性。如LHRH修饰后的PPI靶向卵巢癌细胞递送DJ-1 siRNA，显著降低了卵巢癌细胞的增殖、转移和侵袭能力[30]。在利用LHRH提高PPI递送系统靶向性的同时，Taratula等[31]同时在PPI表面修饰了PEG，该策略有效提高了siRNA的血清稳定性，促进了肿瘤细胞的特异性识别和摄取，从而发挥基因沉默效应，提高肿瘤治疗的疗效。

然而，在研究PPI的细胞毒性时发现，PPI树形分子会改变A431和A549细胞的内源基因表达[32]，因此，PPI可能会影响人类固有基因的功能，这也大大地限制了PPI在临床上的进一步应用。

Figure 6Surface-modified PAMAM dendrimers

A:PEG-modified PAMAM dendrimer;B:Arginine-modified PAMAM dendrimer;C:Lipid-modified PAMAM dendrimer;D:Fluorinated PAMAM dendrimer;E:Hyaluronic acid-modified PAMAM dendrimer

Figure 7Poly (propylene imine) dendrimer (PPI)

3 肽类树形分子

肽类树形分子在广义上是指在中心核、分支单元或者末端基团含有氨基酸或肽序的树形分子，而在狭义上则是指树形分子的整个结构均由氨基酸构成[33]，其中聚L-赖氨酸树形分子(PLL)就是一种典型的肽类树形分子(图8)。PLL由赖氨酸组成，一般以胺为核心，通过带有保护基的赖氨酸之间的缩合-脱保护两个交替的反应，得到不同代数的PLL树形分子[34]。PLL具有良好的生物相容性，可以在生物体内经过酶或者酸的作用发生降解[33]。虽然PLL表面的胺基在生理条件下便可发生质子化携带正电荷，能与siRNA通过静电相互作用形成复合物，但其结构中不含有与PAMAM和PPI类似的叔胺结构，致使siRNA无法通过“质子海绵”效应从内涵体中逃逸出来发挥基因沉默效应[35]。研究人员开始尝试通过对PLL进行结构改造以提高其siRNA递送能力。例如，对PLL表面进行脂质修饰可以提高siRNA递送能力，C18不饱和烷基链修饰的PLL树形分子在体内表现出有效的RNA干扰能力而无明显的细胞毒性[36]。同时，氟化修饰也能增强PLL的递送能力。Cai等[37]设计了基于氟化G2PLL树形分子递送系统，可以提高siRNA在递送过程中的生理稳定性和血清抗性，促进siRNA/树形分子复合物的肿瘤内富集、细胞内化及内涵体逃逸。

Figure 8Poly (L-lysine) dendrimer (PLL)

4 聚甘油类树形分子(PG)

聚甘油类树形分子的研究也较为广泛，其分支单元为甘油，一般以醇为起始原料，通过醇的烯丙基化、烯丙基双键的催化二羟基化两步反应交替可以得到[38]。阳离子胺基末端的聚甘油树形分子表现出良好的siRNA递送能力。Haag课题组一直致力于聚甘油树形分子的研究，Fischer等[39]设计了含有各种阳离子胺基末端的聚甘油树形分子，其中PG-NH2(图9)在转染效率和细胞毒性之间表现出最佳平衡。PG-NH2可以通过将聚甘油树形分子上的羟基以胺基替代得到。研究表明，PG-NH2中胺基取代程度对其递送能力有着显著影响，50%胺基取代的PG-NH2的核酸亲和力最强。与此同时，体内外转染研究结果也表明，只有50%胺基取代的PG-NH2才能有效转染siRNA[40]。为了进一步提高转染效率，Zeng等[41]还对PG-NH2进行了进一步的氨基酸修饰研究。通过在PG-NH2末端修饰不同种类的氨基酸，同时调整氨基酸的组合、氨基酸的数量和PG-NH2的代数，发现组氨酸和色氨酸比例为3/1的双功能化PG-NH2比未修饰的PG-NH2具有更高的递送效率和更低的细胞毒性。这是因为组氨酸中的咪唑基团在弱酸性条件下可质子化，增加siRNA/树形分子复合物的pH缓冲能力，从而促进其内涵体逃逸；同时咪唑基团具有化学惰性，可提高其血清稳定性[42]。疏水性氨基酸色氨酸则发挥与脂质相似的作用，平衡树形分子的电荷及疏水性，从而促进细胞摄取，提高转染效率。因此，氨基酸双功能化修饰可达到协同增效的作用，进一步增强PG-NH2的siRNA递送效果。相似的，组氨酸与精氨酸比例为3/1的双功能化的PG-NH2在NIH 3T3细胞系中也表现出高效的siRNA转染效率和较低的细胞毒性(细胞存活率为90%)[43]。

Figure 9Polyglycerolamine dendrimer (PG-NH2)

5 碳硅烷类树形分子(CBD)

碳硅烷类树形分子具有一个含硅的核心，其骨架通常由碳碳键和碳硅键构成，形成高度疏水的树形分子结构。它的合成通常以带烯基的硅烷为中心核，与甲基二氯硅烷进行硅氢加成反应；随后与格氏试剂反应得到烯基末端树状物，两步反应交替进行得到不同代数的树形分子[44]。碳硅烷树形分子表面连接铵盐后(图10)，可以通过静电相互作用结合siRNA，用于siRNA递送。Weber等[45]的研究表明，G2铵盐末端的碳硅烷树形分子可有效递送siRNA。在对比氧硅键碳硅烷树形分子(CBD-OS)和碳硅键碳硅烷树形分子(CBD-CS)后发现，两者都可有效递送siRNA用于HIV基因治疗[46]，但也都存在各自的不足，氧硅键在水溶液中不稳定，容易缓慢发生水解，影响CBD-OS的广泛应用；CBD-CS不含氧硅键，相对较稳定，但存在siRNA释放困难的问题[47]。此外，铵盐末端的碳硅烷树形分子表面带有大量正电荷，在递送过程中也可能带来毒性问题。为了降低其毒性，研究人员尝试将铵盐连接的一个甲基用羟甲基替代，发现树形分子表面电荷略微降低，其毒性也随之降低[48]；同时还发现利用三甲基磷盐替代铵盐进行修饰后得到的磷盐末端的碳硅烷树形分子具有相对较低的体内毒性，在鱼类胚胎模型中其半数致死量(LD50)比其他阳离子树形分子高10倍以上[49]。

6 三嗪类树形分子

三嗪类树形分子是以卤代1,3,5-三嗪环为分支单元，利用氨基化合物的氨基和卤素之间的反应，将三嗪环连接起来得到不同代数的树形分子[50]。Merkel等[51]研究发现，三嗪类树形分子的中心核结构、末端基团和代数都会影响siRNA的递送。其中刚性的G2三嗪类树形分子比柔性结构类似物表现出更好的基因沉默效应；在刚性三嗪类树形分子上修饰精氨酸或者短链脂质(图11)可以促进其内涵体逃逸以及 siRNA在胞质中释放，从而有效提高了基因沉默效率。Pavan等[52]进一步通过计算机模拟研究了三嗪类树形分子与siRNA之间的相互作用，研究人员预期柔性结构的三嗪类树形分子能够利用其结构的灵活性，增加树形分子与siRNA的结合，但研究结果表明，柔性结构的三嗪类树形分子反而形成了更紧密的球形构象，弱化了树形分子与siRNA 的结合。与其他类型的树形分子相比，三嗪类树形分子在siRNA递送方面的应用相对较少一些，进一步的研究仍在进行之中。

Figure 10Ammonium-terminating carbosilane dendrimer (CBD)

7 两亲类树形分子

在siRNA递送中，树形分子的代数与递送效率有着直接关系，较高代数的树形分子具有更好的siRNA结合能力，其递送效率也较高。但因空间位阻等因素的影响，高代树形分子的制备难度相对较大，批量化生产困难。为了解决树形分子载体“高代高效但难制备”这一共性问题，研究人员制备具有两亲性的较低代数的树形分子，运用自组装的策略，使其组装形成超分子树形分子组装体，以实现高效的siRNA递送。

Figure 11Lipid-modified triazine dendrimer

Yu等[53]结合脂质分子和树形分子载体的优势设计了一系列低代数的两亲性PAMAM树形分子，这类树形分子含有疏水性的烷基长链和亲水性的低代PAMAM树形结构(图12-A)，这两部分是通过click反应连接到一起，在保留树形分子结构明确和独特的多价特性优点的同时，显著降低制备难度；同时，两亲性树形分子自组装形成树形分子纳米胶束以模拟高代球型树形分子，高效地将siRNA 递送至人源的原代细胞和干细胞等多种类型的细胞中，展现出优异的siRNA递送能力。深入的构效关系研究表明此类两亲性树形分子结构中的亲水部分PAMAM的代数和疏水部分烷基链的长度对递送效率都有影响[54]。疏水链缺失或者以亲水性PEG链替代疏水部分所构建的树形分子都不具备两亲性，无法自组装形成胶束递送siRNA；减少亲水部分的末端胺基数量或者缩短疏水部分的烷基链长度，也无法产生显著的基因沉默效应。其主要原因为PAMAM代数过低，表面正电荷基团偏少，则无法与siRNA形成有效的静电相互作用；烷基链长度太短，则组装时的疏水相互作用也会减弱，无法与siRNA形成稳定的组装体；疏水链过长则会使疏水作用增强，形成的复合物过于致密和稳定，siRNA无法实现有效的胞内释放，导致其递送效率也较低。在此构效关系的研究基础上，Liu等[55]进一步调整疏水部分烷基链的数目构建了一类含有两条烷基链的两亲性树形分子(图12-B)，这类两亲性树形分子自组装形成纳米囊泡结构，但在与siRNA相互作用时能自适应重排形成球形胶束结构。这种从囊泡到胶束结构的转变可以实现末端正电荷基团的最大化暴露，有利于与siRNA的静电相互作用，从而更好地结合和保护siRNA。为了提高两亲性树形分子的递送效率，他们将精氨酸修饰于两亲性树形分子的亲水端以提高细胞对siRNA/树形分子复合物的摄取，从而显著增强其基因沉默效率[56]。为了更进一步增加递送系统的靶向性，Dong等[57]利用双靶向肽RGDK对两亲性树形分子递送系统进行修饰，体内实验结果证明使用此靶向递送系统的siRNA有效剂量降低了91.7%(由3 mg/kg降低至0.25 mg/kg)。此外，Liu等[58]还设计了一种含氟bola型两亲性树形分子(图12-C)，在分子中引入缩硫醛键，能够响应于肿瘤细胞中高水平活性氧(ROS)，实现siRNA的按需递送。同时，该分子结构中的氟原子还可以实现氟谱示踪树形分子介导的siRNA递送过程。

此外，这类两亲性树形分子结构中疏水部分的存在使得这类分子能够用于疏水性药物和基因药物的共递送，实现多种药物协同治疗。Li等[59]建立了肿瘤微环境敏感多肽(TMSP)修饰的两亲性树形分子(G0-C14)递送系统(图12-D)，实现siRNA和紫杉醇的共递送。TMSP由细胞穿透肽和屏蔽肽组成，其中屏蔽肽含有基质金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9)敏感的肽段PVGLIG。TMSP被MMP-2/9活化后暴露细胞穿透肽部分，进一步促进纳米复合物的细胞摄取，该共递送系统在人黑素瘤中表现出协同治疗的效果。

除此之外，其他种类的树形分子如聚甘油类和碳硅烷类也被设计成两亲性的结构用于siRNA的递送。研究人员构建了不同代数的聚甘油两亲性树形分子[60-61]，其疏水部分是C18疏水烷基链，亲水部分的聚甘油表面修饰了不同数量的甘氨酸或N,N-二-(3-氨基丙基)-N-(甲基)胺(DAPMA)以通过静电相互作用结合siRNA(图13-A)。进一步研究发现，在疏水部分加入硫辛酸结构使树形分子可以自组装形成生物交联型胶束，在还原条件下交联键断裂实现siRNA的进一步释放[62]。疏水性碳硅烷和亲水性PEG连接也可以形成新型两亲性杂交树形分子(图13-B)，可有效递送siRNA至外周血单核细胞用于HIV治疗[63]。

Figure 12Amphiphilic PAMAM dendrimers

A:Amphiphilic PAMAM dendrimer carrying a hydrophobic C18 alkyl chain;B:Amphiphilic PAMAM dendrimer carrying two hydrophobic C18 alkyl chains;C:Bola amphiphilic PAMAM dendrimer;D:G0-C14 amphiphilic PAMAM dendrimer

Figure 13Amphiphilic polyglycerol dendrimer (A) and amphiphilic carbosilane dendrimer (B)

8 结 语

基于siRNA的RNAi疗法因其特异的基因沉默效应受到广泛关注，2018年首款siRNA药物Onpattro®上市，标志着RNAi疗法从概念走向临床实际应用。然而siRNA分子本身不能在体内发挥其基因沉默效应，需要载体对其进行保护和递送。树形分子作为一种高效的非病毒siRNA递送载体，引起了越来越多的关注。它们的优势在于结构精确可控，具有独特的多价性等等，这些特性使其成为理想的siRNA递送载体。研究学者们对传统树形分子进行了一系列的结构改造，以此开发了各种用于siRNA递送的多功能树形分子递送平台，以期待最大限度地提高递送的有效性和特异性，并将毒性降至最低。在上述各类树形分子递送平台中，聚丙烯亚胺类、碳硅烷类、三嗪类树形分子由于分子本身的毒性或生物相容性不佳等原因使它们在siRNA递送中的应用相对较少；而聚酰胺-胺类、肽类和聚甘油类树形分子具有相对较好的生物相容性，其中聚酰胺-胺类树形分子的研究最为深入，其siRNA递送效果也最为理想。这主要是因为一方面在生理条件下PAMAM树形分子中带正电的胺基基团可与带负电的siRNA通过静电相互作用结合并透过细胞膜将其输送到目标细胞内，另一方面PAMAM树形分子内部的叔胺基团通过“质子海绵”效应促进siRNA/树形分子纳米粒的内涵体逃逸和siRNA的有效释放；反观传统的肽类和聚甘油类树形分子，因无法同时具备结合siRNA和促进其内涵体逃逸及siRNA释放的结构，所以在一定程度上限制了这两类树形分子在siRNA递送中的应用。虽然目前树形分子进行siRNA递送的研究已经取得了一些令人鼓舞的实验结果，但在推进其临床转化的过程中仍存在一些亟待解决的问题：例如如何实现符合药品生产质量管理规范(GMP)要求的树形分子的工业化生产，以及缺乏树形分子体内代谢过程和安全性等的认知研究等。相信在化学、生物、物理、医学等各领域专家的协同合作下，将会有越来越多的树形分子被开发和研究作为siRNA递送载体，其在临床应用中也将日益广泛。