HPLC-MS测定奥美沙坦酯中有关基因毒性杂质

2019-07-03栾保磊徐新军梁桂挺游孟梦刘国柱

中国药科大学学报 2019年3期

栾保磊，徐新军，梁桂挺，游孟梦，刘国柱

(1中山大学药学院，广州 510006；2东阳光药物研究院，东莞 523871)

基因毒性杂质研究是近年来药物质量研究与控制的热点与难点，愈加受到各国官方机构重视，并相继出台指导原则[1-4]。基因毒性杂质在极低浓度时即可与人体内的遗传分子DNA进行化学反应，造成不可逆的损伤，进而导致基因突变，并可能导致肿瘤的发生，因此在药物中被允许的限度非常度低，通常为百万分之一水平，具体按日剂量及毒理学关注阈值(TTC)进行计算。药物中基因毒性杂质的检测对测定方法的专属性与灵敏度具有非常高的要求[5-8]。

奥美沙坦酯(olmesartan medoxomil)结构见图1，是一种前体药物，口服后在胃肠道中迅速完全水解为活性物质奥美沙坦而发挥降血压作用。奥美沙坦是选择性血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)拮抗剂，通过选择性阻断血管紧张素Ⅱ与血管平滑肌AT1受体的结合而阻断血管紧张素Ⅱ的收缩血管作用，主要用于高血压的治疗[9-11]。奥美沙坦酯为长期用药，基于法规要求需要对基因毒性杂质进行研究与控制。奥美沙坦酯(OLM)的重要起始物料N-(三苯基甲基)-5-(4′-溴甲基联苯-2-基)四氮唑(BBTT1)含有约1%～2%的二溴代杂质N-(三苯基甲基)-5-(4′-二溴甲基联苯-2-基)四氮唑(BBTT2)，反应中均会脱掉三苯甲基保护基分别生成5-(4′-溴甲基联苯-2-基)四氮唑(BBT1)和5-(4′-二溴甲基联苯-2-基)四氮唑(BBT2)，两产物结构式见图1，均为潜在基因毒性杂质，杂质研究中易被忽略，存在着极大的质量风险。常用于有关物质检测的HPLC法不能满足检测灵敏度要求，基因毒性杂质的测定是奥美沙坦酯质量控制的难点[12-14]。已有测定奥美沙坦酯中BBTT1和BBTT2的文献报道[15]，但未见奥美沙坦酯中BBT1和BBT2的文献报道，迫切需要建立检测方法以保证产品质量。因此本文拟建立一种LC-MS法同时测定奥美沙坦酯中两种新的基因毒性杂质BBT1和BBT2含量的方法。

Figure1 Chemical structures of OLM，BBT1 and BBT2

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200 高效液相色谱仪配DAD紫外检测器、自动进样器及柱温箱；Agilent 6120单四极杆质谱检测器，配有电喷雾电离源(美国安捷伦公司)。

1.2 试药

乙腈(色谱纯，德国默克公司)；丙酮(色谱纯，美国霍尼韦尔公司)；甲酸(分析纯，成都科龙化学试剂有限公司)；超纯水(美国密理博超纯水仪自制)。奥美沙坦酯(批号OLM-1411001、OLM-1411002、OLM-1411003)，5-(4′-溴甲基联苯-2-基)四氮唑对照品(纯度95.4%)，5-(4′-二溴甲基联苯-2-基)四氮唑对照品(纯度95.1%)均由东阳光药物研究院合成。

2 方法

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件色谱柱： Agilent Zorbax Eclipse

Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：以0.1%甲酸水溶液为A相，乙腈为B相，进行梯度洗脱(0～7 min，60% B；7.0～7.5 min，60% B→100% B；7.5～13 min，100% B；13～13.1 min，100% B→60% B；13.1～20 min，60% B)；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样体积：5 μL；柱后分流比：1∶1。

2.1.2 质谱条件质谱离子源：ESI电喷雾离子化正离子采集模式(ESI+)；干燥气体流速：11 L/min；雾化室压力：310 kPa；干燥气体温度：350 ℃；毛细管电压：3 500 V；选择离子监测模式(SIM)，0～9 min检测离子m/z315和m/z395。

2.2 溶液的制备

以丙酮为空白溶液。分别取BBT1对照品和BBT2对照品约23.4 mg，精密称定，加丙酮溶解并定容至100 mL，摇匀；精密量取上述溶液1 mL，加丙酮稀释定容至50 mL，摇匀，即得对照品储备液。

精密移取对照品储备液2 mL，加丙酮稀释定容至25 mL，摇匀，即得对照品溶液。

取供试品约50 mg，精密称定，置5 mL量瓶中，加丙酮溶解并定容，摇匀，即得供试品溶液。平行配制2份。

3 结果

3.1 系统适用性试验

取空白溶液、对照品溶液依法测定。空白溶液进1针，对照溶液连续进3针。结果显示，对照品溶液中BBT1和BBT2的分离度为6.8(大于1.5)；对照品溶液中BBT1和BBT2峰面积的RSD分别为2.9%和2.7%(小于10%)，说明本法系统适用性良好。

3.2 专属性考察

取供试品约250 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，精密加入对照品储备液2 mL，加空白溶液溶解并定容，摇匀，作为供试品加标溶液。分别取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液，依法测定，记录色谱图，见图2。结果显示，BBT1和BBT2分离度良好，空白无干扰，100%供试品加标溶液较供试品溶液对应峰面积有增加。本法专属性良好。

Figure2 HPLC chromatograms of speciality tests and LOD

1：BBT1；2：BBT2

A:Blank solution；B:Standard solution,BBT1 0.37 μg/mL and BBT2 0.36 μg/mL；C:Sample solution,OLM 10 mg/mL and BBT2 0.04 μg/mL；D:Spiked sample solution,OLM 10 mg/mL,BBT1 0.37 μg/mL and BBT2 0.40 μg/mL；E:LOD solution，BBT1 3.12 ng/mL and BBT2 6.08 ng/mL

3.3 线性关系考察

取对照储备液适量，用空白溶液稀释，分别配制成约0.094，0.188，0.281，0.375和0.563 μg/mL浓度的系列标准曲线溶液。取定量限溶液、系列标准曲线溶液，各进样2针。以两次进样BBT1和BBT2面积平均值分别对其浓度进行二元线性回归。结果显示，BBT1的线性方程为：Y=1.349 5×105X+3.623 2×103，r=0.998，线性范围为0.009 4～0.561 0 μg/mL，BBT2的线性方程为：Y=9.419 5×104X+1.478 3×103，r=0.999，线性范围为0.018 2～0.547 5 μg/mL。本法线性关系良好。

3.4 检测限与定量限测定

取对照品溶液适量，用空白溶液逐级稀释成峰高约为基线噪音10倍的溶液，作为定量限溶液；用空白溶液逐级稀释成峰高约为基线噪音3倍的溶液，作为检测限溶液。取定量限和检测限溶液，依次各进样3次。结果显示，BBT1和BBT2的定量限分别为9.35 ng/mL(S/N=11，RSD=2.4%)和18.25 ng/mL(S/N=12，RSD=1.1%)，检测限分别为3.12 ng/mL(S/N=3.5)和6.08 ng/mL(S/N=4)，见图2-E，表明本方法灵敏度较高。

3.5 加样回收试验

分别称取供试品9份，分别加入适当浓度的对照品储备液，使得加入质量浓度相当于0.094 μg/mL、0.375 μg/mL和0.563 μg/mL，每个浓度水平各配制3份。取供试品溶液、准确度溶液依次进样。结果显示，BBT1和BBT2的平均回收率分别为96.5%和98.0%，总体回收率的RSD(n=9)分别为4.8%和5.1%，本法准确度良好。

3.6 重复性试验

取6份供试品加标溶液，含供试品、BBT1和BBT2质量浓度依次为10 mg/mL，0.37 μg/mL和0.40 μg/mL，依法测定，每份溶液各进样1次，计算每份溶液中BBT1和BBT2的含量。结果显示，6份供试品加标溶液中BBT1和BBT2含量的RSD为3.4%和2.8%。本法重复性良好。

3.7 溶液稳定性考察

取对照品溶液、供试品加标溶液，分别于制备0，6，12 h后，根据“2.1”项下色谱条件分析测定，记录BBT1和BBT2的色谱峰面积，并计算RSD。结果显示，对照品溶液中BBT1和BBT2峰面积的RSD分别为4.7%和5.8%,供试品加标溶液中BBT1和BBT2峰面积的RSD分别为1.0%和1.5%，本法对照品溶液和供试品加标溶液在12 h内稳定。

3.8 样品测定

取BBT1对照品、BBT2对照品和3批奥美沙坦酯适量，按“2.2”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液，对照品溶液配制1份，连续进样3次；供试品溶液每批平行配制2份，各进样1次。用外标法计算供试品中BBT1和BBT2含量，结果见表1。

奥美沙坦酯最大日剂量为40 mg，根据基因毒性杂质研究指导原则，烷基化试剂BBT1和BBT2为潜在基因毒性杂质，按照TTC 1.5 μg计算，限度为37.5 μg/g，但由于BBT1和BBT2为同一类型的基因毒性杂质，限度分别为18.8 μg/g，以两物质的含量合计，限度为不大于37.5 μg/g，3批样品中BBT1和BBT2的含量之和均符合规定。

Table1 Result of content of BBT1 and BBT2 in 3 batches of olmesartan medoxomil

BatchBBT1/(μg/g)BBT2/(μg/g)OLM-1411001NDNDOLM-1411002ND4OLM-1411003ND3

ND:Not detected

4 讨论

4.1 溶液稳定性的考察和溶剂的选择

方法开发初期，曾尝试建立一种同时检测BBTT1、BBTT2、BBT1和BBT2 4种基因毒性杂质的方法，考察后发现，BBT1和BBT2会诱导BBTT1和BBTT2脱保护反应而造成对照品溶液不稳定，回收率不达标等问题，故选择分别建立两种方法检测4个基因毒性杂质，本研究建立一种LC-MS法同时测定奥美沙坦酯中两种基因毒性杂质BBT1和BBT2含量的方法。为了达到足够的灵敏度，奥美沙坦酯的供试品质量浓度需要高达10 mg/mL，试验表明乙腈、甲醇和水中均无法完全溶解，故选择溶解度较好的丙酮作为溶剂。

4.2 梯度的确定

在方法开发初期曾尝试等度洗脱的方法，但在该条件下进样后再进对照溶液BBT1和BBT2的峰面积会明显降低。该问题可能原因为奥美沙坦酯导致信号抑制。最终采用梯度洗脱，分析方法验证表明所建立的梯度洗脱方法具有较好的重复性。

4.3 样品浓度和质谱采集时间的确定

为了获得较好的灵敏度，方法选择的样品质量浓度为10 mg/mL。该浓度下，主成分奥美沙坦酯虽然获得了较强的保留及对称的峰形，但若如此高浓度的奥美沙坦酯进质谱，会严重污染质谱离子源，导致方法耐用性差。因此，所建立的方法只有前9.5 min进行质谱分析并记录质谱SIM色谱图(BBT1在约5.0 min出峰，BBT2在约6.3 min出峰)，9.5 min后通过阀切换至废液，不进质谱分析(奥美沙坦酯在约11.4 min出峰)。