家族性血小板型出血病16型的遗传诊断与咨询

刘 静,张慧娟,王 飞,李 静,韩青云,张荣波

(1.安徽理工大学医学院,安徽 淮南 232001；2.河南省人民医院生殖医学中心,河南 郑州 450003)

血小板无力症(Glanzmann thrombocytasthenia，GT)是最常见的血小板遗传性疾病，ITGA2B和ITGB3纯合或复合杂合基因突变导致血小板膜表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa缺陷引起血小板聚集异常[1]。该疾病由GLANZMANN E首次报道，主要临床特征为血小板聚集缺陷、血栓收缩异常[2-4]，为常染色体隐性遗传。然而，ITGA2B和ITGB3基因的杂合子突变可能表现为常染色体显性遗传的血小板型出血病16型 (platelet-type bleeding disorder-16，BDPLT16)[5]。BDPLT16临床表现为先天性巨血小板减少症，与血小板的大小不均有关，是一种血小板生成障碍，体外研究显示有轻度血小板功能异常[6-8]。1960年，该病首先由CROSS描述了相近的临床病症[9-11]。患者可能没有或仅有轻度增加的出血倾向，表现为出生后不久发病，为终生性的皮肤粘膜出血、淤血、鼻出血、贫血，女性则多见于经期大量出血，血小板不能自发响应多种诱导剂的聚集反应，包括ADP、胶原、肾上腺素等。

本研究对一例临床疑为血小板无力症但表现为常染色体显性遗传的家系患者进行基因突变分析，应用目标区域捕获结合高通量测序技术，并通过Sanger测序验证，明确病因和遗传特征，为临床医生提供准确的诊断依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

先证者(III21)，男，31岁，自幼有出血倾向，多见于皮肤粘膜淤斑、牙龈出血、鼻出血、受伤后出血时间延长，长期严重贫血曾间断输血，临床初步诊断怀疑为血小板无力症。通过询问疾病家族史，患者家族中还有其他类似出血症状患病成员，病情轻重不一，临床信息和家系情况如表1和图1所示。

表1 先证者家族临床资料及基因检测结果

表示先证者，表示男性，○表示女性；●、■表示患病图1 家系图和遗传检测结果

1.2 样本采集与DNA提取

在征得患者及其亲属的同意下，采集先证者及其家族成员的外周血。通过基因组DNA提取试剂盒(北京全式金生物技术公司)提取样本DNA。本研究已经获得安徽理工大学医学院伦理委员会的批准。

1.3 目标区域捕获测序和Sanger测序验证

打断DNA并制备文库，通过核酸探针对目标基因编码区和剪切区附近的DNA进行捕获和富集，然后使用高通量测序平台Illumina HiSeq 2500进行变异检测。最后通过Sanger测序对先证者、父母及其他家系成员进一步验证。

1.4 变异致病性分析

通过检索dbSNP、1000genome、gnomMAD、ClinVar、OMIM等数据库的相关信息以及国内外的文献。

2 结果

2.1 临床诊断与家系分析

结合先证者表型和临床检查结果，医生初始诊断为常染色体隐性遗传的血小板无力症。然而分析家族史信息，疾病传递明显表现为常染色体显性遗传(见图1)，更可能为BDPLT16，待进一步明确诊断。

2.2 高通量测序与Sanger验证

通过生物信息学分析和数据解读，先证者ITGA2B基因检出c.2267+1G>T(NM-000419.3)的杂合变异。Sanger测序结果表明，患者父亲携带ITGA2B基因c.2267+1G>T的杂合变异，而母亲的ITGA2B基因未检出(见图2)，家族其他成员的检测结果也表明，变异与疾病紧密连锁。

图2 先证者及父母 ITGA2B基因c.2267+1位点Sanger测序结果

2.3 变异致病性分析

c.2267+1G>T为剪接donor位点第一位碱基由 G变为T。根据内含子剪切的GT-AG法则，该位点极度保守，变异极有可能导致内含子不能剪接或引起外显子缺失，通常对蛋白功能影响很大。dbSNP、1000genomes、gnomMAD数据库均无该位点的频率信息。ITGA2B基因ClinVar数据库中已报道的15个致病变异，其中3个为剪切突变(见图3)。结合患者的临床表型和变异与在家系中与疾病连锁情况，C.2267+1G>T变异极可能为致病变异，患者疾病可明显诊断为BDPLT16。

图3 ITGA2B基因致病变异谱ITGA2B基因目前已报道15个导致血小板无力症的致病变异。黑色箭头标注为本研究首次发现的致病位点。

3 讨论

BDPLT16是一种罕见的遗传性出血疾病，临床多见于终身性牙龈和皮肤粘膜组织出血，生化检查表现为少量的血小板减少症、巨血小板、血小板聚集减少但凝块收缩正常。与GT的遗传方式不同，BDPLT16表现为常染色体显性遗传，呈现出家族聚集性。Ghevaert等报道了英国一个家庭有5人患有BDPLT16[12]。日本报道了一个遗传4代的家系，其中10人有轻度出血倾向，如鼻出血、皮肤粘膜瘀斑，患者血小板的GPIIb / IIIa复合物的表达降低[11]。

血小板糖蛋白GPIIb与GPIIIa形成GPⅡb/Ⅲa复合物，是纤维蛋白原受体，也是血小板聚集中重要一环，其功能异常将会阻碍血小板与纤维蛋白的结合进而干扰正常的止血机制。GPⅡb/Ⅲa复合物的正常合成需要各个亚基的稳定构象以及二者相互作用才能形成复合物，任何亚基的异常都将影响GPⅡb/Ⅲa复合物的功能异常。

人类ITGA2B基因位于17号染色体q21-23的区域，基因全长17.2 Kb，包含30个外显子[13-14]，编码血小板糖蛋白GBIIb，其是血小板膜粘附蛋白受体复合物GPIIb / IIIa的α亚基，β亚基GPIIIa由ITGB3基因编码。GPIIb / IIIa复合物属于整联蛋白类细胞粘附分子受体，其具有与α和β亚基共同的异二聚体结构。GPIIb / IIIa复合物通过纤维蛋白原的受体介导血小板聚集。异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白Gα13直接结合整合素β3细胞质结构域，并且通过配体结合整合素IIb/β3以及GTP加载Gα13促进Gα13-整合素的相互作用。干扰Gα13表达或Gα13的豆蔻酰化减弱了蛋白激酶c-Src的活化并刺激了小鸟苷三磷酸酶RhoA，从而抑制细胞扩散，加速细胞回缩[15]。

ClinVar数据库已报道ITGA2B基因目前有三个致病性剪接变异(c.1544+1G>A、c.2094+2T>C、c.2602-3C>G)。本研究中，先证者家系中检出ITGA2B基因一个杂合子变异c.2267+1G>T，正常人群该变异频率极低，ClinVar和HGMD数据库及检索相关文献均未有报道，应为首次发现。该位点位于ITGA2B基因22号内含子，为剪接位点，可能导致缺乏GPIIb分子表达，进而造成患者血小板上严重缺乏GPIIb/IIIa而出现相关临床症状。

BDPLT16表现为常染色体显性遗传，患者父母至少有一人携带致病基因，杂合ITGA2B基因突变即可引起BDPLT16。患者通常临床表型差异较大，与遗传背景和环境密切相关。BDPLT16目前尚无有效的治愈方法，出血是主要的临床症状，病情严重可通过输入血制品进行治疗[16]。除输血外，患者应避免使用影响血小板功能的药物，如阿司匹林(非甾体类抗炎药)[17]。BDPLT16或GT患者在儿童早期和青春期使用铁补充剂，以避免出血引起的缺铁性贫血[18]。该类患者一般无法从临床上直接诊断，需要借助基因检测可明确病因。及早的确诊和遗传咨询，有助于临床治疗和预防，进而减轻社会和家庭的经济负担。