胶束电动色谱技术在蛋白质分离分析中的应用研究进展

高凡 王晓飞 张博

摘 要 胶束电动色谱（MEKC）作为一种兼具色谱和电泳分离机理的方法，既具有准固定相与分析物间的相互作用，又可以利用带电分子在电场中迁移行为的差异进行分离。MEKC的这些特点在蛋白质和多肽这类具有高维度数的生物分子的分离中得到了很好的体现。无论是单维分离， 还是多维分离，MEKC都显现出在生物大分子分离方面良好的应用前景。近年来，随着CE-MS的不断发展，出现了很多新的MEKC-MS联用技术，进一步显示了MEKC在蛋白质与多肽分离分析中的应用前景。本文首先对胶束电动色谱技术进行了简介，综述了近年来胶束电动色谱技术在蛋白质分离分析中的研究应用进展，并对其发展前景进行了展望。

关键词 胶束电动色谱; 表面活性剂; 毛细管电泳; 蛋白质; 多肽; 质谱; 评述

1 引 言

蛋白质是由一条或多条肽链组成的复杂的生物大分子，是生物体的重要组成物质，在生物体内参与诸多生理活动。除了肽链上数量庞大的氨基酸序列，蛋白质的复杂性还体现在：（1）肽链内部以及肽链之间的折叠，形成不同的空间结构; （2）蛋白质的分子量和尺寸差异; （3）氨基酸侧链基团和结构域导致的亲疏水性差异; （4）肽链残基以及侧链基团的电离或水解使得蛋白质呈现为两性分子; （5）活性位点不同导致的免疫亲和特异性。从分离的角度看，蛋白质的多重属性使得这类分子具有非常大的样品维度数[1]，它与分离系统的维度数相对应，是指能够确定样品组成的独立变量的数量。这里的独立变量指的是样品的不同属性，即分离可依据的属性。样品维度数越大，说明分离该样品可以依据的属性就越多，也说明样品可能的复杂性，当样品维度数大于分离系统维度数时，可能导致组分峰的无序分布，即无法完全分离; 当样品维度小于分离系统维度数时，通过多维分离系统所获得的高峰容量无法充分利用，会造成分离能力的浪费。蛋白质的高样品维度数为蛋白质的分离分析提供了多种可利用的属性（不同的单维分离方法）以及高峰容量分离方法的建立（多维分离方法）。蛋白质的每一种属性都能够对应至少一种分离方法，如分子量和分子尺寸可以作为尺寸排阻色谱或者凝胶电泳的依据， 疏水性不同可以通过反相色谱达到分离目的，带电量与分子量的关系可用于电泳分离，等电聚焦则利用了等电点和两性分子的特点，而免疫亲和色谱利用了蛋白质的免疫特异性。

胶束电动色谱（Micellar electrokinetic chromatography，MEKC）作为一种特殊的电泳模式，与上面提到的分离方法不同。蛋白质在MEKC中的分离是由蛋白质的电泳淌度以及蛋白质分子与胶束准固定相的相互作用共同决定。Terabe等[2]对MEKC 给出的定义是： MEKC是一种基于可迁移非固态分离介质的电迁移分离技术。电动色谱仪器与毛细管电泳仪器基本一致，不同之处是需要向缓冲溶液中加入表面活性剂，当其浓度大于临界胶束浓度时，通常是50～100个表面活性剂分子的疏水基团聚集到一起，亲水端向外，形成胶束。以胶束作为准固定相的电动色谱即为胶束电动色谱。MEKC具有两个特点[3]：没有静止的固定相，这种准固定相同样会在分离通道中迁移; MEKC是色谱与电泳机理相结合的分离模式。胶束与电解质溶液有不同的迁移性质，中性物质的分离是基于分析物在胶束和溶液中的分配系数不同而获得，而对于带电物质，分离机理则是基于分析物在两相中分配系数的不同， 以及它们在电场下电迁移的差异[4]。

由于MEKC的双重分离机理，电中性分子在MEKC体系中的样品维度数小于分离体系的维度数，无法充分分离。而蛋白质既具有较高的电荷密度，且蛋白质分子之间存在亲疏水差异。因此，对于蛋白质样品，MEKC可以充分体现出其出色的分离能力（图1）。

2 单维胶束电动色谱

2.1 表面活性剂的影响与调控

选择不同的缓冲溶液中表面活性剂和添加剂，是调控MEKC对蛋白质分离效果的最直接方法。表面活性剂在缓冲液中形成胶束，充当了准固定相的角色，对样品提供色谱保留性。作为最常用的表面活性剂，十二烷基硫酸钠（SDS）在MEKC蛋白质分离中应用广泛。SDS由疏水的长烷基链和亲水的SO24组成。当大分子量蛋白质加入缓冲液中时，大量的SDS分子会嵌入或吸附在变性的蛋白质分子上[5]，色谱保留主要通过蛋白质表面与胶束之间产生的相互作用实现。Lamb等[6]利用MEKC对一系列糖蛋白疫苗及其载体蛋白进行分离，发现提高硼酸盐浓度有助于实现基线分离，而SDS浓度由25 mmol/L提高到50 mmol/L， 对白喉类毒素（Dt）和脑膜炎球菌多糖A型-白喉类毒素配合物（MnA-Dt）的分离效果并未明显提高。这一研究将MEKC直接用于临床样品检验，符合临床检测快速、低消耗的特点和要求。与大分子蛋白质不同，肽类分子由于体积小，一般可以自由进出胶束内部而表现出不同的色谱保留性。MEKC在分离小分子多肽时常会表现出非常好的分离效果。脑啡肽是一种小分子神经递质，一般由5个氨基酸残基组成。Huang等[7]基于高灵敏LIF检测，通过MEKC分离8种脑啡肽类多肽，考察了不同SDS浓度下各物质的基线分离情况以及不同缓冲液pH条件下各种肽类似物的出峰时间变化。Wu等[8]用MEKC分离了氨基酸种类、数量相同，但序列不同的三肽，在优化的pH条件下实现了这些细小结构差异小肽的基线分离。

利用MEKC分离蛋白质这类生物大分子时，SDS通常会嵌入到蛋白质内，由于结合表面活性剂数量不同， 会出现同一蛋白的多重峰现象。Cooper等[9]对一个单克隆抗体进行构象分析，发现该单克隆抗体在电泳图中分裂成多个峰，分析表明是由于嵌入的SDS数量不同所导致的，而当SDS浓度远大于临界胶束浓度时，这一现象变得不明显。

在以SDS为表面活性剂对蛋白质分离的MEKC研究中，研究者開发了很多方法，如毛细管内壁涂覆、pH值影响探究、超高温分离，进样方式以及分离载体的开发应用等。在用CZE分离蛋白质时，一个非常重要的问题是蛋白质（尤其是大分子量的）在毛细管内壁的吸附。而MEKC由于有表面活性剂的存在，表面活性剂一般会铺满内壁，充当一个动态的涂层，减少蛋白质的吸附[10]。这一优点使得MEKC可用于分离性质差异微小的大分子蛋白。人转铁蛋白是转运Fe3+必不可少的大蛋白，Nowak等[11]用甲醇作为有机添加剂修饰的MEKC分离了根据Fe3+失去数目划分的4种形式的转铁蛋白（图2）。而由于Fe3+取代的是分子上的H+，所以并未改变蛋白质的带电性，这体现了MEKC在分离细小差异的蛋白质上具有非常优越的性能。Kats等[12]利用MEKC监测了单克隆抗体在pH 2～12条件下的异构体转换，在不同pH条件下能够分离出1～5个信号峰，揭示了pH值对抗体构型的影响。Djordjevic等[13]对MEKC的超高温模式下的分离效果进行了考察，考察温度范围15～115℃，发现塔板数与分离时间的比值随温度升高而增大，但是分离效率先随温度升高，在60℃左右骤降，之后继续升高。这里，导致塔板数-分离时间的比值随温度升高的原因可能有多种，如减少管壁的作用（吸附和解吸动力学状态）、胶束微环境的一致性增加、溶质构象快速变化以及增快传质效率等。然而，温度升高时， 临界胶束浓度增大，柱温升高导致的柱外效应引起的峰展宽，以及高温下胶束发生重组都可能导致分离效果的下降。

2.2 表面活性剂的种类

MEKC中使用的表面活性剂有很多种，如阴离子表面活性剂（如SDS）、阳离子表面活性剂（如CTAB）、两性离子表面活性剂（如CHAPS）、非离子型表面活性剂（如Brij35），以及针对MEKC技术引入的聚合物表面活性剂[21]、可挥发性表面活性剂（PFOA）[22～24]，离子液体[25，26]，甚至一定大小的纳米粒子也可以视为表面活性剂形成的胶束[27]。不同的表面活性剂有不同的带电性和结构，形成胶束的保留性不同，适合分离不同的蛋白质。不同蛋白质与多肽之间的差异可能很大，需选用适当的表面活性剂以得到理想的分离结果，例如强啡肽类多肽的pI≈10，在常用的缓冲液中均以正离子形式存在，如选用SDS作为表面活性剂，由于SDS是阴离子表面活性剂，离子对现象会非常严重。针对强啡肽及其类似物，Furtos-Matei等[28]对多种类型的表面活性剂进行了考察，使用阳离子表面活性剂CTAB可以从13种物质中获得12个色谱峰，其中两种物质会有共洗脱现象，而使用两性表面活性剂CHAPS可以完全分离13种物质（图3）。Lupi等[29]在分离几种结构相近的多肽时，戊酸和SDS均无法实现基线分离，胆酸钠可以获得 良好的分离效果，而非离子型表面活性剂Brij35能达到最好的分离效果。

单一的表面活性剂达到的分离效果经常不理想，与其它类型的表面活性剂混合后， 常能获得更好的分离效果。 Haunschmidt等[30]用SDS和脱氧胆酸盐混合作为表面活性剂，成功基线分离了单一表面活性剂所不能很好分离的胰岛素和人工合成胰岛素类似物，并且结果优于CZE和MEKC。不同的混合胶束体系通常有对应的混合胶束机理。Kang等[31]通过对杆菌肽的分离，研究了MEKC中混合胶束机理，先是选出有最优选择性的两性表面活性剂PAPS，然后将非离子型表面活性剂Brij35加入缓冲液中，解决了使用单一表面活性剂时的峰拖尾的现象。研究者认为，在这一体系中，Brij35合并到PAPS形成的胶束中形成新的胶束，改变了原胶束的空间结构，Brij35的聚氧化乙烯链屏蔽了PAPS的离子基团，减弱了胶束与分析物直接的静电作用，同时Brij35的加入增加了缓冲液的粘度，延长了迁移时间，增长了分离窗口，提高了柱效。

2.3 其它添加剂

环糊精及其衍生物有广泛的选择性，是MEKC中最常用的手性拆分试剂。环糊精衍生物的溶解性通常优于环糊精[32]。作为一种手性添加剂，环糊精要结合到缓冲液中的胶束中才能发挥手性拆分的作用，多见于修饰以SDS为表面活性剂的MEKC中，对具有手性中心的多肽分离效果良好。Donges等[33]利用β-环糊精和有机溶剂改性的SDS-MEKC分离抗凝血酶III的α和β异构体， Chen等[34]利用2-羟丙基-β-环糊精成功分离了带有两个手性中心的二肽。

离子液体是一类熔点在100℃以下的熔融盐[25]，具有良好的水溶性和高导电性，可以作为电解质或缓冲液的添加剂，其中，短链的离子液体具有表面活性剂的性能。Xu等[26]将功能化的离子液体（BDS）作为MEKC的电解质盐和表面活性剂应用在PDMS芯片上，获得了较好的通道内壁动态涂覆效果，避免了样品吸附，并且不影响荧光试剂的灵敏度，在分离荧光试剂以及荧光标记的蛋白质时获得了比其它表面活性剂更高的分辨率。

2.4 MEKC灵敏度

灵敏度是电泳模式（尤其是紫外检测）的主要影响因素，电泳的低进样量和柱容量都在一定程度上制约着紫外检测器的使用。针对灵敏度的问题，研究者开发了多种柱上预浓缩/进样技术，如场放大堆积[14]、大体积上样堆积[15]、动态pH界面[16]和等速电泳[17，18]等。场放大进样是基于背景电解液和样品溶液的导电性不同，在进样时对样品进行富集，Wu等[19]利用该技术对人尿液中的白蛋白和转铁蛋白进行进样富集和分离，富集倍数高，且没有分离效率损失。多种进样方式结合使用，可提高进样量和预浓缩效果， Furmaniak等[20]结合了场放大进样技术和吹扫技术，对人尿液中同型半胱氨酸硫内酯进行了进样浓缩。

3 二维分离中的胶束电动色谱

3.1 二维分离的优势与特点

单维分离方法的峰容量有限，对于蛋白质/多肽这类复杂的生物分子，需要更高分辨率的分离技术。Giddings提出构建多维分离系统的两个准则[1]：维度之间必须正交; 后一维度的分离不能损失前一维度已获得的分辨率。当满足以上两个准则时，多维分离方法的峰容量等于各个维度峰容量的简单乘积。因此，多维分离方法非常适合分离蛋白质/多肽这类高维度数的分子。MEKC作为一种同时兼具电泳特性和色谱特性的分离方法，在蛋白质/多肽的分离分析中可以与多种电泳模式构建二维分离体系。

在二维分离平台的构建中（图4），维度间的联用非常重要，直接影响到样品的转移和分离效果的保持。二维联用的方式有离线联用和在线联用两种，离线方法经常会由于液槽吸附而产生样品损失，人工样品转移导致重现性差，第二维进样体积大而损失分离效率等问题; 相比之下，在线联用技术省却了人工操作，避免了样品损失，且分析的重现性也得到显著改善。针对蛋白质分离的2D-CE平台，在线联用通常要做到樣品低损耗、无交叉污染、连续进样并避免样品扩散、保持电连接， 甚至可更换缓冲液等。

3.2 基于芯片的二维平台

Ramsey等[35]首次在玻璃芯片上构建MEKC分离蛋白质的二维平台，通过控制缓冲液槽的电势与样品槽的电势，在交叉通道处调控液流的方向，从而实现定向脉冲进样，展示了以芯片为基础的MEKC与CZE的联用方式。然而，进入第二维的样品量仅约占进入第一维样品量的10%，造成了样品分析的不完全。如果在第一维采用分离速度更慢的模式或保证分离后样品扩散缓慢，第二维依然使用快速分离（如MEKC等），就可以在一定程度上减小样品损失。Shadpour等[36]在PMMA芯片上以SDS-CGE作为第一维分离; 第二维采用很短的分离通道进行快速MEKC分离，获得了的峰容量>1000。在该方法中，同样是通过流路的方向调控脉冲式的维度间进样。与文献[35]不同的是，该方法第一维度是SDS-CGE，进样时第一维的分离通道中电场是反向的，只有进入十字交叉区域的第一维流出物才会被第二维分离。这样减小了样品损失，又避免了在十字交叉区域处可能产生样品的返混现象。该方法联用成功的原因之一是毛细管凝胶电泳可以在一定程度上抑制样品的扩散，为脉冲进样提供时间。此后，该研究组[37]增加了分离通道的长度，以获得更大的峰容量。

3.3 基于毛细管的二维平台

电泳分离的最成熟载体是毛细管，很多文献报道了以毛细管为分离通道的MEKC二维电泳平台的研究。Dovichi的研究组[39]构建了基于毛细管的CSE-MEKC分离平台，对很多实际样品如病变组织[38]和单个哺乳动物细胞的蛋白质指纹谱测定，效果良好。在此平台中，作者通过将两根毛细管对接并置于第二维缓冲液槽中，既达到维度间样品传递目的，又成功替换了第一维中的缓冲液。为了提高通量，还建立了5道并行的CSE-MEKC平台[40]。然而，CSE-MEKC平台的峰容量不高，原因在于第一维的分离时间过长导致的样品扩散、 维度间样品转移导致的区带展宽以及第二维MEKC过短的分离时间。Sheng等[41]开发了一个带有中空纤维膜的十通阀用以联用MEKC-IEF分离蛋白质。中空纤维膜的作用是更换第一维缓冲液，十通阀的使用满足了维度间非连续进样，因为第二维的等电聚焦有区带聚焦效果，减小了由于第一维的样品扩散导致的峰展宽。Yang等[42]也利用中空纤维膜对2D-CE的接口开展了研究，由于特殊的多孔性，中空纤维膜理论上很适合作为二维电泳的接口。但是，中空纤维膜对蛋白质具有一定的吸附作用。 另外， 由于作为接口的膜内壁不带电荷，不会形成双电层结构，这一段的液流驱动属于力学驱动，即抛物线形液流，会产生峰展宽。

4 胶束电动色谱与质谱联用

4.1 MEKC-ESI-MS联用技术

质谱能够提供丰富的分子量信息用于蛋白/多肽鉴定，已成为蛋白/多肽分析中最常用的检测方式，电喷雾离子源（ESI）具有软电离特性，因此成为液相分离最常用的质谱检测器。组成MEKC准固定相的表面活性剂是引起MEKC与质谱兼容性差的最主要因素。为了克服这一缺点，实现MEKC-MS高效联用，目前的解决方案有两种[43]：第一种是避免将准固定相引入质谱系统，包括毛细管部分充满法[44]、准固定相反向迁移法[45]和准固定相去除法[46]等; 第二种是将准固定相引入质谱，例如易挥发性表面活性剂[22，24，47]、高聚物表面活性剂[21，48]等。

4.1.1 毛细管部分充满法 Nelson等[49]和Koezuka等[50]基于准固定相的迁移速率通常要小于电渗流以及分析物迁移速率的原理，在传统MEKC基础上，建立了毛细管部分充满法（PF-）MEKC。在PF-MEKC中，毛细管的第一部分充入含有准固定相的背景电解液，样品主要在这一区域发生分离。其余部分充入不含有准固定相的质谱友好的背景电解液（如醋酸铵缓冲溶液），供样品分离后进入，在胶束抵达离子源前停止分离，从而避免胶束进入离子源。Koezuka等[50]在PF-MEKC中使用了在酸性条件下迁移速率非常低的非离子型表面活性剂，分离鉴定了神经降压素和血管紧张素的类似物。然而，胶束缓冲边界处会产生样品的区带展宽，检测窗口的长短由表面活性剂的有效淌度决定， 而非胶束的有效淌度决定，总分离体积减小，这些都是PF-MEKC的不足之处。

4.1.2 准固定相去除 准固定相反向迁移是避免胶束进入离子源的另一种方法。Yang等[51]通过调节背景电解液至pH 5.9，使电渗流的迁移速率略小于SDS胶束的正极迁移速率，避免了胶束进入离子源，并且增长了分离窗口，提高了分辨率。准固定相正极迁移的方法适用带正电物质和在准固定相中的保留性不强的中性物质，但是对于带负电的物质，迁移速度的方向并不一定能够指向出口[52]。准固定相去除是很早就使用的一种与质谱联用的方法，这一操作类似于二维电泳中以MEKC作为第一维分离方法，在接口处进行背景电解液的替换。例如，Lamoree等[53]设计的联用两根毛细管来进行电压切换和缓冲液的更新，在MEKC分离后的分析物由CZE进入质谱。此外，Kinde等[54]设计了一个联用MEKC-MS的芯片装置，利用自由流区带电泳连续萃取低分子量的阳离子分析物，当使用涂层试剂抑制电渗流后，高效萃取出两种多肽。该工作也为MEKC-MS分离鉴定蛋白多肽提供了思路，即设计一个能够不断将蛋白/多肽萃取至无表面活性剂的缓冲液中，且尽可能保留分离效果的装置。但是，由于准固定相的去除需要进行缓冲液的更换，所以在接口处难免会存在区带展宽， 甚至样品损失的问题。

4.1.3 质谱兼容型表面活性剂 能够直接联用MEKC-ESI-MS的表面活性剂的开发一直是研究的重点。其中，半挥发性的表面活性剂（如全氟辛酸铵）以及聚合物表面活性剂的研究尤其关键。Ishihama等[47]首次将全氟辛酸作为MEKC的表面活性剂，利用其较强挥发性的特点，与质谱联用，发现在低浓度下仅存在有限的离子化抑制现象。之后，Petersson等[55]将PFOA的浓度提升到100 mol/L进行了MEKC-MS实验，结果表明，离子化抑制并不严重。鉴于PFOA的这个特性，很多研究者进行了MEKC-MS联用的研究[23，24]。虽然质谱对PFOA有一定的耐受性，并不能完全适应。Ortner等[56]以PFOA作为表面活性剂，采用MEKC-MS对几种胰岛素类似物进行了分离鉴定，发现PFOA并不能显著降低离子化抑制效应。Vieira等[57]通过实验证实了背景电解质中，两倍于SDS浓度的全氟辛酸铵会引起50%的离子化抑制。虽然半挥发性表面活性剂仍然存在局限性，但仍是生物大分子MEKC-MS分析中的重要选择。

4.2 MEKC-DESI-MS与MEKC-DART-MS联用技术

解吸电喷雾离子源（DESI）可以直接检测未经处理的样品，具有很高的鹽耐受性[58]。在2%（w/w）盐浓度存在下， 102 ng/mL浓度水平的分析物也可以被检测到[59]。Myung等[60]提出了DESI对蛋白质等生物大分子的特殊离子化机理，认为DESI是一种比ESI更软的离子源。Shin等[61]发现，随着分子量增加，DESI的信噪比降低，其对于分子量一般不超过17 kDa的整体蛋白具有较好鉴定效果。Zare课题组[62]用旋转喷雾盘在对前端MEKC、CE的流出物点板的同时，已经点好的样品点会旋转至DESI离子源被解吸离子化。然而，DESI对MEKC和MS联用以及对蛋白质分析具有一定的局限性。由于解吸离子化的方式导致DESI的离子化效率比较低，并且会存在一定的样品损失，可能出现生物体系中低丰度蛋白无法检测和重现性差等问题。随着常压离子源的广泛应用，研究者开发了实时直接分析（DART）质谱[63]。Chang等[64]利用在共轴针尖接口基础上设计了DART的离子化方法，考察了CE-DART-MS对难挥发盐和表面活性剂的耐受性，发现SDS和硼酸钠的使用相对于纯水溶液并没有产生离子化抑制。并且，当使用浓度高达50 mol/L的SDS和硼酸钠时，离子峰的信号强度也可达到原强度的75%。在此基础上，该课题组进行了MEKC-DART-MS实验，得到了良好的检测限和重现性。DART对盐和表面活性剂的耐受性良好， 在MEKC-MS分离检测蛋白/多肽方面具有巨大的潜力。

4.3 MEKC-APCI-MS與MEKC-APPI-MS联用技术

能够与MEKC联用的大气压离子源还包括大气压化学电离源（APCI）和大气压光电离源（APPI）。Takada等[65]的研究证明了MEKC-APCI-MS的可行性，显示了APCI对高浓度盐和表面活性剂具有优于ESI的耐受性。虽然APCI与MEKC的兼容性好，但对蛋白质的检测灵敏度并不高，这主要是由于APCI对蛋白质这一类极性较强的大分子的离子化效率不佳，这也限制了APCI在实际生物样品中的应用。Mol等[66]将APPI离子源引入MEKC-MS中，分离检测了多种中性小分子，显示了APPI在盐和表面活性剂存在条件下对弱极性小分子鉴定的优越性。He等[67]基于MEKC-APPI-MS平台，利用混合分子胶束实现了安息香衍生物的手性分离与鉴定。虽然APCI和APPI对蛋白质等大分子的鉴定能力较弱，但作为MEKC-MS联用的软离子源，对于弱极性小分子的分离分析已成为ESI的有力补充。

5 总结与展望

MEKC结合了色谱和电泳技术的优点，在蛋白/多肽的分离中具有极大的应用潜力。通过对MEKC缓冲液组成以及分离介质的设计优化，充分利用MEKC与其它分离手段的联用，能够获得优良的分离结果。通过方法优化，减少或替代进入质谱的表面活性剂，可以在一定程度上解决MEKC-MS联用中的问题。质谱是蛋白/多肽的分离分析最常用的技术之一，因此，开发新型质谱兼容型表面活性剂、改善MEKC分离介质以及开发新型CE-MS接口等，是MEKC用于蛋白/多肽分离分析中需要重点研究的内容。

References

1 Giddings J C. J. Chromatogr. A， 1995， 703（1-2）： 3-15

2 Terabe S， Otsuka K， Ichikawa K， Tsuchiya A， Ando T. Anal. Chem.， 1984， 56： 111-113

3 Pyell U. Electrokinetic Chromatography： Theory， Instrumentation and Applications. John Wiley & Sons， Ltd， 2006： 3-32

4 Terabe S. Ann. Rev. Anal. Chem.， 2009， 2（1）： 99-120

5 Weber K， Osborn M. J. Biol. Chem.， 1969， 244（16）： 4406-4412

6 Lamb D H， Summa L， Lei Q P， Duval G， Adam O. J. Chromatogr. A， 2000， 894（1）： 311-318

7 Huang Y， Duan J P， Chen Q R， Chen G N. Electrophoresis， 2004， 25（7-8）： 1051-1057

8 Wu Y， Xie J， Wang F， Chen Z L. J. Sep. Sci.， 2009， 32（3）： 437-440

9 Cooper B T， Sanzgiri R D， Maxey S B. Analyst，  2012， 137（24）： 5777-5784

10 Rassi Z E. Electrophoresis， 2010， 31（1）： 174-191

11 Nowak P， Spiewak K， Nowak J， Brindell M， Wozniakiewicz M， Stochel G， Koscielniak P. J. Chromatogr. A， 2014， 1341（9）： 73-78

12 Kats M， Richberg P C， Hughes D E. Anal. Chem.， 1997， 69（3）： 338-343

13 Djordjevic N M， Fitzpatrick F， Houdiere F. Electrophoresis， 2001， 22（12）： 2398-2402

14 Lin H J， Hsieh K P， Chiou S S， KouH S， Wu S M. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2016， 131： 497-502

15 Wang C C， Chen J L， Chen Y L， Cheng H L， Wu S M. Anal. Chim. Acta，  2012， 744（18）： 99-104

16 Belal F， El-Din M S， Tolba M， El-Awady M， Elmansi H. Microchem. J.， 2016， 127： 11-21

17 Ren H X， Liu X， Jiang S X. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2013， 78-79： 100-104

18 Matczuk M， Foteeva L S， Jarosz M， Galanski M， Keppler B K， Hirokawa T， Timerbaev A R. J. Chromatogr. A，  2014， 1345： 212-218

19 Wu Y W， Liu J F， Xiao T X， Han D Y， Zhang H L， Pan J C. Electrophoresis， 2009， 30（4）： 668-673

20 Furmaniak P， Kubalczy P K， Glowacki R. J. Chromatogr. B， 2014， 961： 36-41

21 Liu Y J， Wu B L， Wang P， Shamsi S A. Electrophoresis，  2016， 37（7-8）： 913-923

22 Akamatsu S， Mitsuhashi T. J. Sep. Sci.， 2014， 37（3）： 304-307

23 Svidrnoch M， Lnenickova L， Valka I， Ondra P， Maier V. J. Chromatogr. A， 2014， 1356： 258-265

24 Orazio G， Asensio-Ramos M， Hernandez-Borges J， Rodriguez-Delgado M A， Fanali S. Electrophoresis， 2015， 36（4）： 615-625

25 Pandey S. Anal. Chim. Acta，  2006， 556（1）： 38-45

26 Xu Y H， Fang L Y， Wang E K. Electrophoresis， 2009， 30（2）： 365-371

27 Qin W D. Electrophoresis， 2007， 28（17）： 3017-3023

28 Furtos-Matei A， Day R， St-Pierre S A， St-Pierre L G， Waldron K C. Electrophoresis， 2000， 21（4）： 715-723

29 Lupi A， Viglio S， Luisetti M， Zanaboni G， Cetta G， Iadarola P. Electrophoresis， 2000， 21（10）： 1985-1991

30 Haunschmidt M， Ortner K， Hainz K， Bradt E， Sternbauer L， Buchberger W， Klampfl C W. Electrophoresis， 2010， 31（9）： 1560-1564

31 Kang J W， de Reymaeker G， van Schepdael A， Roets E， Hoogmartens J. Electrophoresis， 2015， 22（7）： 1356-1362

32 Juvancz Z， Kendrovics R B， Ivanyi R， Szente L. Electrophoresis， 2008， 29（8）： 1701-1712

33 Donges R， Romisch J， Stauss H， Brazel D. J. Chromatogr. A， 2001， 924（1）： 307-313

34 Chen Y， Zhang J H， Zhang L， Chen G N. Electrophoresis， 2010， 31（9）： 1493-1497

35 Ramsey J D， Jacobson S C， Culbertson C T， Ramsey J M. Anal. Chem.， 2003， 75（15）： 3758-3764

36 Shadpour H， Soper S A. Anal. Chem.， 2006， 78（11）： 3519-3527

37 Wang S Y， Njoroge S K， Battle K， Zhang C， Hollins B C， Soper S A， Feng J. Lab Chip， 2013， 12（18）： 3362-3369

38 Kraly J R， Jones M R， Gomez D G， Dickerson J A， Harwood M M， Eggertson M， Paulson T G， Sanchez C A， Odze R， Feng Z， Reid B J. Dovichi N J. Anal. Chem.， 2006， 78（17）： 5977-5986

39 Hu S，Michels D A， Fazal M A， Ratisoontorn C， Cunningham M L， Dovichi N J. Anal. Chem.， 2004， 76（14）： 4044-4049

40 Zhu C R， He X Y，Kraly J R， Jones M R， Whitmore C D， Gomez D G， Eggertson M， Quigley W， Boardman A， Dovichi N J. Anal. Chem.， 2007， 79（2）： 765-768

41 Sheng L， Pawliszyn J. Analyst， 2002， 127（9）： 1159-1163

42 Yang C， Liu H C， Yang Q， Zhang L Y， Zhang W B， Zhang Y K. Anal. Chem.， 2003， 75（2）： 215-218

43 Silva M. Electrophoresis， 2013， 34（1）： 141-158

44 Quirino J P. Electrophoresis， 2011， 32（6-7）： 665-668

45 Yang L Y， Harrata A K， Lee C S. Anal. Chem.， 1997， 69（10）： 1820-1826

46 Kinde T F， Lopez T D， Dutta D. Anal. Chem.， 2015， 87（5）： 2702-2709

47 Ishihama Y， Katayama H， Asakawa N. Anal. Biochem.， 2000， 287（1）： 45-54

48 Wang X C，Hou J G， Jann M， Hon Y Y， Shamsi S A. J. Chromatogr. A， 2013， 1271（1）： 207-216

49 Nelson W M， Tang Q，Harrata A K， Lee C S. J. Chromatogr. A， 1996， 749（1-2）： 219-226

50 Koezuka K， Ozaki H， Matsubara N， Terabe S. J. Chromatogr. B， 1997， 689（1）： 3-11

51 Yang L Y，Harrata A K， Lee C S. Anal. Chem.， 1997， 69（10）： 1820-1826

52 Somsen G W， Mol R， de Jong G J. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（25）： 3978-3991

53 Lamoree M H， Tjaden U R， Vandergreef J. J. Chromatogr. A， 1995， 712（1）： 219-225

54 Kinde T F， Lopez T D， Dutta D. Anal. Chem.， 2015， 87（5）： 2702-2709

55 Petersson P， Jornten-Karlsson M， Stalebro M. Electrophoresis， 2010， 24（6）： 999-1007

56 Ortner K， Buchberger W， Himmelsbach M. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（14）： 2953-2957

57 Vieira D B， Crowell A M J， Doucette A A. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2012， 26（5）： 523-531

58 Takats Z， Wiseman J M， Gologan B， Cooks R G. Science， 2004， 306（5695）： 471-473

59 Jackson A U， Talaty N， Cooks R G， Van Berkel G J. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， 2007， 18（12）： 2218-2225

60 Myung S， Wiseman J M， Valentine S J， Takats Z， Cooks R G， Clemmer D E. J. Phys. Chem. B， 2006， 110（10）： 5045-5051

61 Shin Y S， Drolet B， Mayer R， Dolence K， Basile F. Anal. Chem.， 2007， 79（9）： 3514-3518

62 Barbula G K， Safi S， Chingin K， Perry R H， Zare R N. Anal. Chem.， 2011， 83（6）： 1955-1959

63 Cody R B， Laramee J A， Durst H D. Anal. Chem.，  2005， 77（8）： 2297-2302

64 Chang C L， Xu G G， Bai Y， Zhang C S， Li X J， Li M， Liu Y， Liu H W. Anal. Chem.， 2013， 85（1）： 170-176

65 Takada Y， Yoshida M，Sakairi M， Koizumi H. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 1995， 9（10）： 895-896

66 Mol R， de Jong G J， Somsen G W. Anal. Chem.， 2005， 77（16）： 5277-5282

67 He J， Shamsi S A. Electrophoresis， 2011， 32（10）： 1164-1175