基于基因芯片的荧光分析方法在甲状腺乳头状癌相关BRAFV600E突变高灵敏及特异性检测中的应用

魏佳 高嘉雪 王瑶琪 王振新 孟宪瑛

摘 要 研发了一种基于DNA芯片（DNA microarray）的荧光分析方法， 并将其用于检测甲状腺乳头癌相关的BRAFV600突变。本方法采用三链杂交体系， 首先将单链DNA（ssDNA）捕获探针固定在微阵列芯片基底上，制备DNA芯片;以其为反应平台， 加入ssDNA目标物与ssDNA捕获探针进行杂交;最后加入荧光分子Cy5的修饰ssDNA标记ssDNA目标物， 检测荧光信号。在优化的实验条件下， 本方法对BRAFV600E突变型ssDNA目标物的检测灵敏度达到亚纳摩尔级（0.25 nmol/L）， 且具有3个数量级的线性范围， 并能够从突变型ssDNA目标物和野生型ssDNA目标物的混合物中区分出低至0.1%的BRAFV600E突变型ssDNA目标物。利用本方法对15例临床甲状腺组织样本的BRAFV600E突变水平进行了分析， 实验结果与常规Sanger测序法检测结果一致， 表明本方法具有良好的实用性。

关键词 甲状腺乳头状癌; BRAFV600E突变; DNA芯片

1 引 言

BRAF基因（B-Rapidly accelerated fibrosarcoma proto-oncogene）在黑色素瘤、甲状腺癌等多种人类癌症中均具有发生突变的倾向， 被认为是相关癌症的主要治疗靶点[1～4]。自第一个致癌的BRAF突变在21世纪初被证实后， 科研究人员又相继发现多种过度活化的BRAF致癌突变（包括BRAFV600E、BRAFV600A和BRAFV600G）[5，6]。其中， BRAFV600E突变（缬氨酸（V）单位点突变为谷氨酸（E））占BRAF致癌突变的90%。研究表明， BRAFV600E选择性抑制剂疗法可有效延長BRAFV600E突变患者的总生存期[1，2]。

由于BRAFV600E突变在各种癌症中广泛存在， 对BRAFV600E突变水平的高灵敏度和高选择性分析对于肿瘤患者的诊断、治疗和预后具有重要意义[3～5]。 Sanger测序[6]、微阵列芯片[7]、结合等位基因特异性聚合酶链反应的熔融曲线分析[8，9]、免疫组化[10，11]和光学生物传感器[12，13]等技术均能实现BRAF突变的定性与定量分析[14～18]。其中， 微阵列芯片仅需使用极少的样品量即可获得高通量的全基因组突变或单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism， SNP）分析结果， 且一张微阵列芯片可同时分析多个样本， 极大地节省了实验时间和成本。例如， 科研人员使用微阵列芯片从黑色素瘤样本中成功区分出BRAF突变型和野生型样本[7，17，18]。然而， 由于缺乏灵敏度和选择性， 利用微阵列芯片检测手术切除或活体检查的癌组织样本中较低等位基因频率（<5%）的BRAFV600E突变却少有报道。近三十多年， 中国甲状腺癌的发病率不断增加， 其中， 甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid cancer， PTC）占甲状腺癌病例的85%以上[19]， 且在25%～45%的甲状腺癌患者中存在BRAF突变[20，21]。另外， BRAFV600E突变是PTC的恶性程度和预后重要指标， 即BRAFV600E突变为阳性与患者死亡密切相关[22]。

本研究通过改变ssDNA捕获探针上突变位点的位置， 对不同BRAFV600E的突变位点进行了优化。同时， 结合不对称聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction， PCR）扩增策略， 制备了具有高选择性和高灵敏度的DNA微阵列芯片（简称DNA芯片， DNA microarray）， 用于检测BRAFV600E突变， 并成功用于检测通过手术切除的PTC组织样本中BRAFV600E的突变水平。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

晶芯SmartArrayer 136微阵列芯片点样系统、晶芯LuxScan 10K微阵列芯片扫描仪、高分子三维基片D、聚四氟乙烯网格围栏（北京博奥生物有限公司）; TC-5000梯度PCR仪（英国Techne公司）; 5415R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）; HPC-250CL恒温恒湿箱（上海申贤恒温设备厂）。

实验中所使用的单链寡核苷酸（ssDNA）序列（上海生工生物工程股份有限公司合成）如表1所示; 组织基因组DNA提取试剂盒、多功能DNA纯化及回收试剂盒（百泰克公司）; 十二烷基硫酸钠、柠檬酸钠缓冲液、甲醛溶液（阿拉丁公司）; OneTaq热启动DNA聚合酶2×预混液（美国NEB公司）。其它化合物均为分析纯， 购于北京化工厂。实验用水为Milli-Q（美国Millipore公司）制备的超纯水（18.2 MΩ cm）。

2.2 临床组织样品的制备

甲状腺组织标本取自吉林大学第一医院甲状腺外科行甲状腺手术的PTC患者， 已征得患者同意。采用组织基因组DNA提取试剂盒提取样本DNA， 并作为不对称重叠扩增PCR实验的模板， 通过两个独立的PCR步骤扩增基因组DNA。具体操作如下：将10 μL oneTaq热启动DNA聚合酶2×预混液、1 μL F1、1 μL R1、1 μL模板DNA混合， 加水至20 μL， 在TC-5000扩增仪上进行两步扩增， 扩增条件为94℃预变性3 min后进行30个循环（94℃解链30 s， 47℃退火20 s， 68℃引物延伸20 s）， 68℃延伸5 min， 迅速降温至4℃; 将此双链的反应产物作为第二步PCR的模板， 扩增出单链的ssDNA， 将25 μL oneTaq热启动DNA聚合酶2×预混液、2.5 μL F1、2.5 μL模板（此模板中包含第一步反应中剩余的少许部分R1）混合， 加水至50 μL， 反应步骤与第一步相同。经过第二步不对称PCR后， 采用多功能DNA纯化及回收试剂盒对获得的粗品进行纯化。用杂交缓冲液稀释纯化后所得产物， 直接进行SNP分析。

2.3 DNA芯片的制备

本实验中共设计了12种针对BRAFV600E不同突变位点的氨基修饰的ssDNA捕获探针（Probe 1E、3E、5E、7E、9E、1W、3W、5W、7W、9W、7A、7G， 如表1所示）， 将不同浓度的ssDNA捕获探针溶解于点样缓冲液中（3×SSC、0.1% （w/V） SDS和1.5 mol/L甜菜碱）， 采用接触法在醛基修饰的三维高分子D基片上进行点样。点样后将微阵列芯片置于温度为37℃， 湿度为75%的恒温恒湿箱中孵育12 h， 再依次用清洗缓冲液（1×SSC， 0.01% （w/V） SDS， 30 mL）和水各清洗3次。随后将微阵列芯片置于含0.1 mol/L乙醇胺的PBS（pH 7.5， 50 mmol/L PB， 0.15 mol/L NaCl）中，在30℃下孵育1 h， 以封闭芯片表面未反应的醛基。最后， 用PBS和水各洗涤3次， 离心（480 r/min， 1 min）甩干， 并用聚四氟乙烯围栏将所制备的微阵列芯片分成12个独立的子阵列， 得到DNA芯片。

2.4 BRAFV600E突变DNA的检测

将模拟样本（合成的4种ssDNA目标物（Target E、W、G、A）及其混合物）和纯化后的不对称PCR产物分别溶解在杂交缓冲液（3×SSC， 0.1% （w/V） SDS）中， 将30 μL上述溶液分别加入到每个子阵列中， 44℃下杂交2 h， 按照以下步骤进行清洗：30 mL杂交缓冲液37℃下清洗3次， 5 min/次， 30 mL清洗缓冲液25℃下清洗3次， 5 min/次， 30 mL水4 ℃下清洗3次， 3 min/次， 离心甩干后， 再向每个子阵列中加入30 μL 200 nmol/L溶解在标记缓冲液（1×SSC， 0.1%（w/V）SDS）中的Cy5修饰的标记ssDNA（Label）， 并在30℃孵育1 h， 按照如上所述的步驟洗涤和干燥后， 使用芯片扫描仪提取阵列点的荧光信号值。相对荧光信号强度（F）定义如下：F=Fsample/Fblank， 其中Fsample为样品的荧光信号强度， Fblank为空白样品的荧光信号强度， 采用不含ssDNA目标物的杂交缓冲液作为空白样品。荧光信号的平均值和标准偏差均由6个重复信号点的信号值计算得到。

3 结果与讨论

3.1 DNA芯片反应条件的优化

构建的DNA芯片荧光检测方法的原理如图1所示。氨基修饰的ssDNA捕获探针通过席夫碱反应固定于醛基修饰的芯片基底; 一部分ssDNA目标物与ssDNA捕获探针进行杂交， 另一部分与Cy5标记的ssDNA完成杂交， 以获得荧光检测信号。Cy5具有较好的光稳定性和较高的量子产率（0.28）， 有助于提高检测灵敏度。

首先考察了ssDNA捕获探针突变位点位置对ssDNA目标物杂交效率和选择性的影响。ssDNA捕获探针包含25个核苷酸， 包括间隔区（T10）和与相应的ssDNA目标物杂交的ssDNA片段。BRAFV600E突变位点位于捕获探针5'末端开始的的第1、3、5、7、9位。其中， 捕获探针Probe 1E、3E、5E、7E或9E与BRAFV600E突变型ssDNA目标物Target E完全互补， 而捕获探针Probe 1W、3W、5W、7W或9W与野生型ssDNA目标物Target W完全互补。如图2所示， ssDNA捕获探针上突变位点的位置对ssDNA目标物杂交效率和选择性有极大影响。除了Probe 5E和5W， 随着BRAFV600E突变位点距探针5'末端距离的增大， 与之杂交的ssDNA目标物5'端游离出的ssDNA片段随之增加， 空间位阻增大， 从而使杂交效率降低， F逐渐降低。然而， 完全互补双链DNA（dsDNA）与单碱基错配dsDNA的F比值却不断增加， 即检测的灵敏度降低而选择性变好。dsDNA的熔点温度与其序列密切相关， 相对于其它dsDNA， 突变位点位于位置5的dsDNA熔点温度较低。该现象导致在相同的杂交温度下， Probe 5E和Probe 5W与相应的ssDNA目标物杂交效率较低， 检测信号较弱。综合考虑检测灵敏度和选择性， 在后续实验中使用突变位点位于位置7的捕获探针（Probe 7E和Probe 7W）检测ssDNA目标物。

由于每个dsDNA都具有其特定的熔点温度， 因此， 杂交效率会受到杂交温度的影响。过低的杂交温度不能完全消除DNA目标物的二级结构， 而过高的杂交温度可能导致dsDNA的双螺旋解旋。 如图3所示， F受杂交温度影响很大。在44℃杂交温度下， 完全互补dsDNA的F最大， 表现出较高的杂交效率。因此， 选择44℃为最佳杂交温度。

3.2 模拟样本中BRAFV600E突变的检测

为了考察该DNA芯片对BRAFV600E突变检测的选择性， 将4种ssDNA目标物（包含1种野生型Target W和3种突变型Target E、G和A）分别与4种ssDNA捕获探针修饰的芯片共同孵育。通过杂交形成4个完全互补的dsDNA和12个单碱基错配的dsDNA。4个完全互补的dsDNA分别代表野生型BRAFV600（wild-type）、具有A等位基因的BRAFV600（BRAFV600E突变）、具有C等位基因的BRAFV600（BRAFV600A突变）和具有G等位基因的BRAFV600（BRAFV600G突变）基因组DNA。如图4所示， 完全互补的dsDNA均表现出较强的荧光信号。其中， 具有BRAFV600E突变的完全互补dsDNA的荧光信号比其它对应单碱基错配dsDNA的荧光信号高13倍以上（图4A）。以上结果表明， 构建的基于DNA芯片荧光检测方法具有良好的选择性，

增加而线性增大， 检出限（3σ）为0.25 nmol/L。与其它SNP检测方法（如电化学生物传感器[23]、表面声波生物传感器[24]、微悬臂生物传感器[25]等）相比， 本方法具有较低的检出限， 能够满足临床实际样品的检测需求。等位基因频率的定量分析在疾病诊断方面具有重要意义， 本研究在保持模拟样本中ssDNA目标物总量不变的条件下， 改变Target E和Target W的比例， 考察本方法对等位基因频率的测定能力。如图6所示， 对于总量为3 pmol的混合ssDNA目标物， 最低可检出丰度为0.1%的Target E（F大于空白样品σ）， 优于文献[8]报道的方法。以上结果表明， 基于DNA芯片的荧光分析方法可用于灵敏、特异地分析复杂样品中的BRAFV600E突变。

3.3 實际样本中BRAFV600E突变的检测

为了考察本方法的实用性， 对4名良性甲状腺结节（BTN）患者和11名PTC患者临床样本甲状腺组织中的BRAFV600E突变水平进行了分析。在优化实验条件下， 对组织提取的基因组DNA的不对称PCR产物进行了检测。与100 ng/mL不对称PCR产物杂交， 并使用Label标记后， 通过计算Probe 7E阵列点的平均荧光信号强度与Probe 7W阵列点的平均荧光信号强度的比值表示BRAFV600E突变水平。如图7所示， 约50%的PTC组织表现出较高的BRAFV600E突变等位基因频率水平（>20%）， 而BTN组织则表现出相对较低的BRAFV600E突变的等位基因频率水平（<15%）。此实验结果与商业化Sanger测序法的检测结果高度一致（约80%）。此外， 本方法可检测低至100 ng/mL的PCR产物， 远低于Sanger测序法的检出限（20 μg/mL）。

4 结 论

建立了基于DNA芯片的荧光分析方法， 通过优化DNA捕获探针的序列和杂交温度， 选择性地检测BRAFV600E突变。在最佳实验条件下， 本方法能够区分野生型BRAFV600和3种BRAFV600突变， 且对BRAFV600E突变等位基因的检出频率低至0.1%。此外， 本方法对15名临床患者甲状腺组织样本中BRAFV600E突变水平的检测结果与商业化Sanger测序法检测结果相当。结合不对称PCR扩增策略， 本方法在检测不同临床样品中的BRAFV600E突变方面具有很大的潜力， 为甲状腺癌的治疗或预后提供了一种新方法。

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