蛋白组学在肝癌中的应用研究

袁佳慧

摘 要：近年来，人们在基因组学的研究上有了巨大的进展，如研究者利用宏基因组学克隆技术筛选获得全新的功能基因和活性物质，大大促进了医学和生物技术工程的快速房展以及人类基因组测序中每条染色体的DNA分子大小，包含的编码基因、非编码基因和假基因的数目，编码基因的举例。然而基因的表达是有选择性的，生命体的所有生命现象都是由蛋白质去执行完成的，所以在人们对生命现象研究的过程中，蛋白质已经成为研究的热点，而蛋白组学就是研究蛋白质的有力方法，因此蛋白组学已经成為研究的热点。将通过查阅文献的方式对蛋白组学在肝癌方面的研究方法及进展进行总结与展望。

关键词：蛋白组学的研究;肝癌中的应用

中图分类号：F24     文献标识码：A      doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2019.14.045

蛋白组学是指大规模研究蛋白质的特征，其中包括蛋白质的表达、修饰、蛋白质之间的相互作用等，由此获得蛋白质水平上疾病发生的机理、细胞代谢等过程的认识的一门学科。近年来，随着蛋白组学研究技术的不断发展，蛋白组学已被应用于很多领域，例如在疾病研究中发现新的标志物、探索遗传病的发病原因、为更快更好的研制药物提供技术支持、对食品科学提供新思路，同时对于微生物界的研究也有很广的应用。其中，蛋白组学应用于人类疾病的研究最为广泛，例如的肝癌的研究。目前，肝癌是最常见的疾病，有较高的发病率，致死率很大，并且呈现上升趋势。因此，有研究者将蛋白组学应用于肝癌的研究中。

1 蛋白组学技术

1.1 蛋白质的沉淀

蛋白质的分离技术在不断地改进与创新中。研究蛋白质的分离可以为之后蛋白质的鉴定提供较优的原材料。现在常见的有盐析法和有机溶剂沉淀法。而有机溶剂相比中性盐来说，机溶剂沉淀法的分辨力和提纯效果比盐析法更好。

1.1.1 盐析法

盐析法是操作较为简便的一种沉淀蛋白质的技术，将中性盐加入在蛋白质溶液中，中性盐将破坏蛋白质表面的水化膜来沉淀蛋白质。虽然操作简便、可以保护蛋白质、适用范围也较广，但是它的缺点也很多，例如提纯浓度不高，无法得到足够纯度的蛋白质。例如张煜先利用硫酸盐盐析法分级分离大豆酸沉蛋白，再用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行分析，最终得出了此方法操作简单，可在短时间内使不同大小的酸沉蛋白沉淀出来。

1.1.2 有机溶剂沉淀法

有机溶剂沉淀法相比于盐析法来说，分辨力更高一些，提纯效果要更好一些。因为有机溶剂不仅可以破坏蛋白质表面的水合层，而且有机溶剂还可以使中性离子间的静电引力增强，这样蛋白质就会沉淀下来。但有机溶剂法仍不能得到足够纯度的蛋白质，需要后续的加工，另外蛋白质也易由变性，有机溶剂的极大使用也会带来回收、储存的麻烦。有机溶剂沉淀也广泛的应用，如张恭勤，张一新，谢维刚等提取无蛹突蛋白质。将含有丰富蛋白质的蚕蛹晒干、破碎、去皮，再用有机溶剂反复沉淀蛋白质，得到了大量无蛹臭的白色蚕蛹蛋白质。

1.2 蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离技术是不断改进和发展的，最开始利用简单的离心技术，虽然能在一定程度上对物质进行分离，但仅利用物理方法无法实现蛋白质的彻底分离，分离后仍混有较多杂质，而蛋白质质谱技术要求较精确，所以蛋白质的分离技术不断向更准确、更精确的方向发展。目前主要的分离技术有离心法，电泳法以及色谱技术等。

1.2.1 离心法

在这些技术中比较简单的方法是离心法，离心技术是通过离心力来分级蛋白质。此方法虽操作简便、快速，但无法完全分离各组分，如陈如梅等人应用离心的方法获得球蛋白提取液。一般，离心法无法将物质完全分离，处理后产物仍混有较多杂质，需要在离心后采用其他技术进行进一步分离。

1.2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法的原理是用液体作为流动相搭配高压输液系统，在色谱柱中装入混合溶剂，缓冲液等流动相。再抽离柱内成分后进行检测，从而分离样品，如高旭东利用高效液相色谱检测黄芩苷，盐酸小檗碱和大黄素;色谱法在目前能较好分离蛋白，并且具有较高的分离效率、分析速度、检验灵敏度和较少的样品用量、较好的选择性，易于自动化。张元梅等利用高效液相色谱法鉴定柑橘果实中18种类黄酮的含量时，说明了此方法的优缺点，缺点即不能进行相关蛋白质的具体检测。

1.2.3 双向电泳

同时利用蛋白质等电点和分子量的差异进行电泳分离的方法叫双向电泳法，第一向是等电聚焦电泳，第二向是SDS—PAGE电泳。之后的蛋白质呈现二维分布，水平方向是蛋白质在等电点上的差异，垂直方向上是蛋白质分子量上的差异。这个方法具有高灵敏度和高分辨率，方便的图像分析处理与质谱分析匹配的优点;但这种技术对于有些蛋白质还难于有效分离、梯度不稳定，并且胶内酶解过程即费时、又费力，又使这项技术难以实现自动化。例如沈飞英等人用双向电泳技术研究家蚕催青前期的胚胎蛋白质，检测到家蚕催青前期的467个蛋白质斑点。

1.3 蛋白质的鉴定

将蛋白质分离出来后，要对其进行鉴定。目前主要的蛋白质鉴定方法为和蛋白质质谱技术，下面将重点介绍这两种方法。

1.3.1 双向电泳

利用蛋白质等电点和分子量的差异进行电泳分离的方法叫双向电泳法。双向电泳的分离图像可以对组织蛋白质表达的分子量和等电点等进行初步鉴定，并可以预测蛋白质点出现的位置。例如谭永梅等利用双向电泳技术有效的分析了冠突散囊菌与veA基因相关的差异蛋白，更好的认识冠突散囊菌的产孢机理。

1.3.2 蛋白质质谱技术

质谱法分析蛋白质的原理是将蛋白质分子转化为离子，在一定的电场与磁场的共同作用下将具有不同质荷比的蛋白质分离开来。此方法灵敏度高、操作简便、准确性高、所需时间短的优点，但质谱仪的造价十分昂贵，使用成本高。例如张丽君等人利用多维色谱-串联质谱联用技术检测出小鼠肝脏质膜蛋白质中的126种蛋白质，其中包括41种膜蛋白。

2 蛋白组学在肝癌研究中的应用

2.1 肝癌的起因

肝癌的发生是由于体内多种基因的共同变化所引起的，而基因转录的产物为蛋白质，蛋白质是人体生命活动的执行者，所以研究蛋白质的差异有利于对癌变的认识。如周海军等将正常人的肝细胞系与肝癌细胞的肝细胞系进行对比，发现有12个蛋白质的糖基团发生改变，论证了蛋白质糖基团的改变在肝癌的发生中起着作用。因此，用蛋白组学对肝癌进行研究，可以使人们了解肝癌的起因，进而预防肝癌的发生。

2.2 肝癌的诊断

尽早确诊肝癌对于肝癌患者的治疗与康复十分重要。对肝癌的诊断主要是寻找其标志物。早期人们开始用甲胎蛋白作为其标志物，目前仍是使用最佳的标志物。但随着研究蛋白组学技术的发展，对肝癌的其他标志物的研究也在不但深入。例如高尔基体73蛋白、肝癌生长因子、异常凝血酶原……

2.2.1 甲胎蛋白

甲胎蛋白属于糖蛋白，在人体内的含量不高。甲胎蛋白与肿瘤的發生相关，它有许多功能：结合和转运、维持血浆渗透压。甲胎蛋白对于细胞的增长和抑制都起着作用。当甲胎蛋白超过一定的范围后，肝癌发生的机率会很大。甲胎蛋白不仅可以检测肝癌，同时也可以作为肝癌转移与治疗效果的指标。

2.2.2 高尔基体73蛋白

高尔基73蛋白在正常的人体中也存在，但其含量很低或者几乎没有，但在肝癌患者的体内含量较高。甲胎蛋白的敏感性较低，尤其是在肝癌转移的方面。付超等人经实验研究得出，高尔基体73蛋白的敏感性远远高于甲胎蛋白，具有很好的实用的临床价值，在未来有可能成为人们诊断肝癌的新型标志物。

2.2.3 肝癌生长因子

肝癌生长因子是肝癌和它周围血管生长的必需物质，属于多肽类物质。随着恶性肿瘤的形成和生长，肝癌生长因子会扩散到其周围的血管里。高文斌等人发现手术前后恶性肿瘤的大小，甲胎蛋白和肝癌生长因子都有变化，并且肝癌生长因子的变化更为显著，具有更高的敏感性。肝癌生长因子的较高的敏感性，使其可以诊断早期肝癌、判断肿瘤大小。如果可以配合其他检测肝癌的技术，会有更好的效果。

2.2.4 异常凝血酶原

近来越来越多的研究表明，异常凝血酶原具有相当的研究价值。殷正风等人经研究表明，当肿瘤的直径大于或等于2.1cm时，异常凝血酶原的含量会随之增加。因此，异常凝血酶原可以作为肝癌的标志物。

2.3 肝癌的转移

肝癌患者死亡的主要原因是转移和复发，肝癌的转移和复发是患者长期生存和手术效果的最大的困难。目前，有的学者为了更深入的了解肝癌的转移与复发，用蛋白组学进行研究。如孟春城等人研究检测了血管内皮细胞生长因子等蛋白质，探究肝癌的转移和复发的影响因素，得出了肝癌的转移与复发与血管内皮细胞生长因子、尿激酶型纤溶酶原酶活物等蛋白质的表达无关。还有毛华等人研究了分裂原激活蛋白激酶p38信号传导通路在抑制血管内皮细胞生长因子诱导肝癌转移，得出了血管内皮细胞生长因子除了提供癌细胞增殖的营养外，还可以通过分裂原激活蛋白激酶p38信号引导癌细胞，导致肝癌的转移。通过对比肝癌患者转移前后体内蛋白质含量的差异，可以得出肝癌转移的原因及影响因素。

2.4 肝癌的治疗

肝癌目前的主要治疗方法是外科手术切除，但因为肝癌患者在早期可能有转移现象，再加上我国大多数肝癌患者在患肝癌的同时，伴有肝功能的下降，所以手术切除的作用并不完全。随着蛋白组学的发展，其在肝癌的治疗中也发挥着作用。例如Ding等运用蛋白组学技术，得出了一些差异蛋白质不仅可以作为肝癌诊断的标志物，还可以减弱肝癌转移的能力，为肝癌的靶向性治疗提供了研究基础，提高肝癌治疗的成功率。

3 总结与展望

随着社会的发展，人们对蛋白质的研究技术也在不断发展。质谱法会进一步突破，研究出使用成本较低的仪器;高效液相色谱可以定量分析蛋白质的差异表达，可以分离过酸或分子量过小的蛋白质。

蛋白组学也应用于细胞生物学、神经生物学、寻找疾病分子标记和药物靶标等许多的方面，对肝癌的探究也日益深入。通过对比肝癌患者与正常人体内的差异蛋白，有助于研究肝癌的起因、转移以及肝癌的治疗方法，降低肝癌的发病率、提高治疗的成功率。蛋白组学为肝癌的研究提供了一个全新且有力的平台。研究不断地创新，技术不断发展。

现在，人们已经在肝癌的起因、诊断、转移、治疗的方面有了一些研究，找到了部分标记蛋白。在未来，可以利用蛋白组学找出具有更高敏感性的肝癌标志物，更早的发现肝癌患者，使其尽早接受治疗，增加康复率;找到引起肝癌的转移与复发的主要蛋白，研制出抑制此类蛋白质的药物，防止肝癌患者的病情加重;将蛋白组学应用于临床治疗上，结合其他治疗肝癌的技术，尽量弥补手术切除的缺陷，降低复发率。使肝癌不再是威胁人类生命的主要疾病。

参考文献

[1] 黄循柳，黄仕杰，郭丽琼，等.宏基因组学研究进展[J].微生物学通报，2009，36（7）：1058-1066.

[2] 温家根，周宏灏，张伟，等.药物基因组学在药物研发中的转化与应用[J].中国药理学通报，2013，29（4）：445-449.

[3] 尹稳，伏旭，李平.蛋白质组学的应用研究进展[J].生物技术通报，2014，（1）：32-38.

[4] 陈建国.中国肝癌发病趋势和一级预防[J].临床肝胆病杂志，2012，28（4）：256-260.

[5] 李峰，关勇军，陈主初.蛋白质组学及其在肿瘤研究中的应用[J].生物化学与生物物理进展，2001，28（2）：164-167.

[6] 谭利芬，肖超斌.蛋白质盐析的实验探究[J].化学教育，2008，29（6）：37-38.

[7] 张煜，王建英，王晶妍.硫酸铵盐析法分级分离大豆酸沉蛋白[J].河南师范大学学报：自然版，2011，39（6）：99-100.

[8] 马颖哲，李秀东.热变性和有机溶剂沉淀联合法提纯超氧化物歧化酶[J].吉林大学学报（医学版），1996，（5）：555-556.

[9] 张恭勤，张一新，谢维刚，等.用有机溶剂提取无蛹突蛋白质的方法：，CN86101511[P].1988.

[10]张宏一.蛋白质组学研究技术及其进展[J].生物技术通报，2005，（4）：31-35.

[11]陈如梅，杜水芹.谷物籽粒各类蛋白质的离心分析法[J].上海农业科技，1990，（1）：39-39.

[12]高旭东，师永清，陈士恩，等.双波长HPLC测定栀子金花丸中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的含量[J].国际药学研究杂志，2015，42（3）：409-412.

[13]张元梅，周志钦，孙玉敬，等.高效液相色谱法同时测定柑橘果实中18种类黄酮的含量[J].中国农业科学，2012，45（17）：3558-3565.

[14]张国庆，廖杰，于力方.双向电泳技术在蛋白质组研究中的应用[J].标记免疫分析与临床，2003，10（03）：39-41.

[15]钟伯雄，陈金娥，颜新培，等.家蚕催青后期胚胎蛋白质双向电泳图谱分析[J].昆虫学报，2005，48（02）：143-148.

[16]邵帅，曲晓波.蛋白质提取分离和结构鉴定技术[J].长春中医药大学学报，2006，22（2）：82-83.

[17] 张颖，杨舸.蛋白质组学研究的有效工具——双向电泳鉴定技术[J].重庆高教研究，2010，29（5）：66-68.

[18] 桑石磊，谭玉梅，葛永怡，等.运用双向电泳技术分离鉴定冠突散囊菌veA相关蛋白[J].贵州农业科学，2014，（8）：124-128.

[19]王岚，刘骁勇，张华宁，et al.生物质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J].生物技术通讯，2007，18（1）：166-168.

[20] 曹锐，张丽军，聂松，等.多维色谱-串联质谱联用技术分离和鉴定小鼠肝脏质膜蛋白质[J].中国生物化学与分子生物学报，2005，21（1）：134-142.

[21]李若林，秦雪.蛋白质组学在原发性肝癌研究中的应用[J].国际检验医学杂志，2009，30（7）：688-689.

[22]周海君，刘银坤，崔杰峰，等.人肝癌细胞系的糖蛋白质组学研究[J].生物化学与生物物理进展，2006，33（1）：59-64.

[23]杨广顺，杨宁.原发性肝癌近20年的诊治进展和发展趋势[J].中国实用外科杂志，2002，22（1）：9-11.

[24]徐海峰，杨华瑜，张宏冰，等.改变肝癌早期诊断和治疗现状的新肝癌血清标志物[J].基础医学与临床，2008，28（1）：104-108.

[25]常彬霞，辛绍杰.甲胎蛋白及其临床应用研究进展[J].世界华人消化杂志，2010，18（6）：576-580.

[26]付超，齐军，李学祥，等.高尔基体蛋白73（GP73）检测在肝细胞癌中的应用价值[J].中国肿瘤，2010，19（8）：553-556.

[27]高文斌，戚晓军.血清恶性肿瘤生长因子检测在肝癌介入治疗中的意义[J].现代免疫学，1998，（2）：126-126.

[28]殷正丰，崔贞福，康晓燕，等.异常凝血酶原酶免疫测定法作为肝癌标志物的研究[J].中华肝胆外科杂志，2001，7（8）：503-504.

[29]孟春城，陈孝平.VEGF、uPA、ICAM-1和PCNA蛋白质表达与肝癌转移复发的关系[J].中华外科杂志，2002，40（9）：673-675.

[30]毛华，袁爱力，赵敏芳，等.分裂原激活蛋白激酶p38信号传导通路在抑制血管内皮细胞生长因子诱导肝癌转移的实验研究[J].中华消化杂志，2000，20（1）：14-16.

[31]叶胜龙.原发性肝癌介入治疗的现状及评价[J].中华肝脏病杂志，2002，10（3）：555-558.

[32]Ding SJ，Li Y，Tan YX，Jiang MR，Tian B ，Liu YK，Shao XX，Ye SL，Wu JR，Zeng R，Wang HY，Tang ZY，Xia QC.From proteomic analysis to clinical significance：overexpression of cytokeratin 19 correlates with hepatocellular carcinoma metasis.

[33]李孜.蛋白質组学研究进展[J].热带医学杂志，2003，3（1）：103-108.

[34]曾嵘，夏其昌.蛋白质组学研究进展与趋势[J].中国科学院院刊，2002，17（3）：49-51.