循环miRNA-21与心房颤动发病机制的初步研究

谭利辉 唐春仕 卢新林 陈文江

【摘要】 目的 探讨血浆循环miRNA-21是否与心房颤动（房颤）的发生有关，并初步探讨循环 miRNA-21参与房颤发生的机制。方法 选择2014年3月至9月于心血管内科住院的房颤患者112例作为房颤组，非房颤患者99例作为对照组，用qRT-PCR检测其血浆循环miRNA-21的表达;并采用mirFocus和starBase等生物信息学软件对miRNA-21进行生物信息预测。结果 房颤患者与对照组间年龄、性别、基本病史和生化检查等差异无统计学意义（P>0.05）;房颤患者血浆循环miRNA-21表达水平较对照组明显升高（P<0.01）;ROC曲线分析发现血浆循环miRNA-21预测房颤的曲线下面积为0.70（P<0.01）;生物信息学预测发现miRNA-21的KEGG信号通路主要有MAPK信号通路和TGF-beta信号通路，其靶基因主要是TGFB2、TGFBR1、TGFBR2。结论 血浆循环miRNA-21可能参与房颤的发生，并且可以作为房颤的生物标志物;而其有可能通过调控MAPK信號通路和TGF-beta信号通路而导致房颤的发生。

【关键词】 miRNA-21;心房颤动;生物标志物;信号通路

中图分类号：R541.75   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.05.010

【Abstract】 Objective To investigate whether plasma circulating miRNA-21 is related to the occurrence of atrial fibrillation，and to explore the mechanism of circulating miRNA-21 in the occurrence of atrial fibrillation.Methods 112 patients with atrial fibrillation who hospitalized in cardiovascular department from March to September 2014 were selected as atrial fibrillation group，and 99 patients without atrial fibrillation as control group.The expression of circulating microRNA-21 in plasma was detected by qRT-PCR，and bioinformatics software such as mirFocus and starBase were used to perform the biological information prediction of miRNA-21.Results There was no statistically significant difference in age，gender，basic history and biochemical examination between atrial fibrillation patients and the control group（P>0.05）;the expression level of circulating miRNA-21 in patients with atrial fibrillation was significantly higher than that in the control group（P<0.01）;ROC curve analysis found that area under curve of plasma circulating miRNA-21 which was used to predict atrial fibrillation was 0.70（P<0.01）;bioinformatics prediction discovered that the KEGG signaling pathway of miRNA-21 mainly consisted of MAPK signal pathway and TGF-beta signal pathway，and its target genes were mainly TGFB2，TGFBR1 and TGFBR2.Conclusion Plasma circulating miRNA-21 may participate in the occurrence of atrial fibrillation，and can be used as biomarker of atrial fibrillation.And it may lead to the occurrence of atrial fibrillation by regulating MAPK signaling pathway and TGF-beta signaling pathway.

【Key words】 miRNA-21;atrial fibrillation;biomarker;signaling pathway

心房颤动（Atrial fibrillation，简称房颤）是临床上最常见的心律失常，其可发生在任何年龄阶段的人群，但是主要发生在老年人群[1～2]。房颤正在逐渐成为危害公共健康的重要问题，有效且安全的房颤治疗手段也成为临床上日益迫切的需要。房颤的治疗主要是对症治疗和防治并发症，通常是经行心律控制和心率控制。然而，对于房颤始终没有彻底有效的方法，主要是由于其发病机制还不清楚。

近年来，非编码RNA逐渐成为医学研究热点，尤其以微小RNA（MicroRNA，miRNA）研究最热。现大量研究[3～7]证实miRNA参与调节房颤的发生发展，与心房重构密切相关;理论上来说，任何参与调节心房结构重构、电重构、离子重构和自律性增高相关基因的miRNA表达失调，都可能与心房颤动的发生和发展相关，但是对于心血管系统疾病而言，活体组织不易获得，因此为miRNA与房颤的研究带来了一定困难。然而，随着研究的深入，现在已有报道将血浆、血清或者尿液等中的循环miRNA作为房颤发生发展的标志物[8～11]，如研究证实血浆中循环miRNA-150[12]在房颤患者中的表达明显高于对照组，并与C型超敏反应蛋白密切相关。因此，通过检测循环血中的miRNA，为房颤发病机制和诊治措施的研究提供了一个新的方向。有研究[5]报道证实miRNA-21通过调控其下游靶基因Spry1而导致房颤发生，同时，在对房颤患者左心房组织研究中发现房颤患者miRNA-21高表达，并与心房胶原（Collagen-1，Collagen-3）含量和Spry1的减少有关，也与结缔组织生长因子高表达有关;另外，将miRNA-21敲除后发现心房纤维化减轻和房颤发生率下降[13～16]。亦有研究证实miRNA-21通过调节金属基质蛋白酶2、血管转化生长因子beta（Transforming growth factor beta，TGF-β）等而导致心房纤维化，从而导致房颤的发生[17～19]。因此，我们假设房颤患者循环血miRNA-21与房颤发病相关，并进行相关研究。

1 对象与方法1.1 研究对象 本次研究选择2014年3月至9月于湖南省郴州市第四人民医院心血管内科住院的房颤患者112例作为房颤组，同时以无房颤的本科住院患者99例作为对照组。房颤组纳入标准：①经心电图、动态心电图记录到房颤者;②合并心衰的患者经治疗后心功能恢复到NYHA心功能分级的Ⅰ级或Ⅱ级;③患者年龄：18～75岁;④同意签署手术知情同意书。排除标准：①可逆性房颤，其中包括甲状腺功能异常、急性酒精中毒、外科手术后等;②近3个月有心梗、PCI、CABG、瓣膜置换者;③曾接受过外科手术治疗房颤者;④肾衰需透析者;⑤妊娠或哺乳期妇女;⑥严重肝功能不全者;⑦严重炎症、恶性肿瘤患者。对照组纳入标准：①经心电图、动态心电图记录到窦性心律患者;②合并心衰的患者经治疗后心功能恢复到NYHA心功能分级的Ⅰ级或Ⅱ级;③患者年龄：18～75岁;④同意签署手术知情同意书。对照组排除标准同房颤组。经合格筛选患者入院6小时内以EDTA抗凝管抽取2 mL静脉血，并于4小时内进行离心（3000rpm，4℃，10分钟）分离血浆，保存于-80℃冰箱，以备后续实验用，并收集患者基本病史和生化检测指标。

1.2 miRNA 实时荧光定量检测 miRNA提取（miRcute miRNA提取分离试剂盒，DP501）、逆转录（miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒，KR201）、荧光定量（miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒SYBR Green，FP401）试剂盒均由天根生化科技（北京）有限公司提供，另外，miRNA-21（CAACACCAGUCGAUGGGCUGU）荧光定量上游引物（hsa-miR-21-5p qPCR Primer，CD201-0093）也由其提供，下游引物为通用引物。实验方法皆按照试剂盒说明书进行。荧光定量检测在LightCycler480 上进行，变性2分钟，94℃;PCR循环中模板变性20秒，94℃;退火、延伸34秒，60℃;共35个循环。最后结果由LightCycler480 Software 1.5进行分析。本研究采用2-ΔCt相对定量方法进行数据分析：ΔCt（实验组）=Ct（实验组目标基因）-Ct（实验组内参基因）;ΔCt（对照组）=Ct（对照组目标基因）-Ct（对照组内参基因）。

1.3 miRNA-21生物信息学预测 选择mirFocus（http：//mirfocus.org/pathway_kegg.php）和starBase[20，21] （http：//starbase.sysu.edu.cn）两个生物信息学软件预测miRNA-21的靶基因及KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信号通路，并了解其生物学功能。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 5（GraphPad Software Inc，CA，USA）进行数据分析，所有计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料采用χ2检验或Fisher检验;采用受试者工作特征曲线 （Receiver operating characteristic curve，ROC）进行标志物曲线分析，判断血浆miRNA-21是否可作为房颤的生物标志物，ROC曲线下的面积值（Area under curve，AUC）在>0.5的情況下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好;应用 Gene Ontology（http：//geneontology.org/）数据库对miRNA-21 的靶基因集合进行生物学过程和分子功能 GO 注释层次分类及富集分析、显著性分析，检验水准：α=0.05;利用 KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）数据库中 Pathway 子数据库对 hsa-miR-28 的靶基因进行信号转导通路富集分析， 通过 Fisher Exact Test 计算P值，检验水准：α=0.01;Bonferroni P为经过Bonferroni法校正后的P值，检验水准：α=0.05。

2 结  果2.1 两组一般资料的比较 本研究共纳入211例患者，其中房颤患者112例，非房颤对照组99例，两组人群年龄都为中老年人，年龄差异无统计学意义（P>005），且两组人群在性别、病史、生化检查等方面比较差异无统计学意义，详见表1，说明两组匹配较好，具有较好的可比性。

2.2 血浆miRNA-21 实时荧光定量结果 经过血浆miRNA提取、逆转录，并行实时荧光定量检测，发现房颤患者血浆循环miRNA-21的表达水平（4.85±054） 高于非房颤对照组（3.64±0.50），差异有统计学意义（t=1689，P<0.01）。见图1。

2.3 血浆miRNA-21 ROC曲线分析 对血浆循环miRNA-21预测或判断房室颤动进行ROC曲线分析发现，按照观察指标的评价标准，血浆循环miRNA-21 预测房颤的效果较好（AUC=0.70，95%CI：0.58～0.81，P<0.01）。见图2。

2.4 miRNA-21生物信息学分析 mirFocus和starBase两个生物信息学软件预测miRNA-21的靶基因及KEGG信号通路详见表2。由此可见，miRNA-21主要通过MAPK信号通路和TGF-beta信号通路进行调控靶基因的表达;其靶基因主要是TGFB2、TGFBR1、TGFBR2，而血管转化生长因子主要是参与心脏结构重构导致纤维化，推测miRNA-21有可能通过调控血管转化生长因子而导致房颤的发生和发展。

3 讨  论  房颤过去多被认为是心血管疾病的并发症，现在由于充分认识到房颤将导致血栓栓塞、心功能衰竭等不良后果，以及由此导致的死亡率和致残率升高，随着人口的老龄化，房颤发病率正逐步上升，许多心血管专家已经将房颤作为独立的疾病[22～24]，因此，房颤的防治显得日益重要。miRNA与房颤发病机制的研究，主要集中在心房结构重构与电重构两方面。有学者[25～26]提出了“miRNA失衡致心律失常假说” 即在心脏中存在上百种miRNA，其中部分miRNA通过调控其靶基因miRNA的翻译过程参与了心肌细胞正常的电生理网络系统，正常时这些miRNA间处于平衡状态，在病理因素影响下，miRNA间平衡被打破，导致其调控的靶基因miRNA表达改变，从而影响心房电重构及结构重构，诱发房颤的发生，因此，如果纠正这些失衡的miRNA，则有可能会为房颤的诊治提供新的方法和依据。

miRNA-21在心脏组织中的研究较多[13，15，16，18]，而在血浆中的研究数据还比较缺乏[14，17]。本研究通过对211例患者进行分析发现，血浆循环miRNA-21在房颤组较非房颤组呈现明显差异表达，说明血浆循环miRNA-21有可能参与了房颤的发生;通过ROC曲线分析发现，血浆循环miRNA-21 预测房颤的效果较好，说明血浆循环miRNA-21有作为房颤筛选的生物学标志物的潜能，虽然其特异性不是很好，但是却具有简便性，作为临床筛选指标未尝不可;通过对miRNA-21生物信息学分析发现，miRNA-21可能与MAPK信號通路和TGF-beta信号通路等有关系，可能通过调控其通路信号分子而导致心脏纤维化进程，从而导致房颤的发生和发展。然而，其具体参与机制，还有待后续细胞功能学实验和动物实验证明。对人体心房颤动发病机制进行研究具有一定难度，主要是难以获取心脏组织，而最近研究显示循环miRNA在血浆、尿液等稳定存在并可作为疾病标志物[27～28]，该方法样本获取较为简单，故血浆miRNA-21在心房颤动的发病机制研究及防治方面极具前景。

参 考 文 献

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