踝管综合征对大鼠糖尿病足病变发展的促进作用

秦小勇 张冉

【摘要】 目的 探索踝管综合征是否对大鼠糖尿病足病变的发展有促进作用。方法 链脲佐菌素（55 mg/kg）腹腔注射制备糖尿病大鼠;将糖尿病大鼠后肢随机分为卡压组（A组）、松解组（B组），在A组大鼠一侧后肢踝管处血管、神经行卡压手术，在B组大鼠一侧后肢踝管处血管、神经行探查手术，同时在A组、B组大鼠一侧足底制作创面，6周后取材制作病理切片，显微镜下观察踝管处血管、神经及足底创面的组织病理学改变。结果 A组与B组比较，A组大鼠足底创面组织中的血管、血管内皮细胞明显减少，A组大鼠足底创面组织中的血管内皮生长因子（VEGF）、神经生长因子（NGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达明显降低，平均光密度相对值比较差异有统计学意义（P<001）。结论 踝管综合征对大鼠糖尿病足病变的发展有明显促进作用。

【关键词】 糖尿病足;糖尿病大鼠;踝管综合征

中图分类号：R688   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.05.003

【Abstract】 Objective To explore whether tarsal tunnel syndrome can promote the development of diabetic foot disease in rats.Methods Diabetic rats were prepared by intraperitoneal injection of streptozotocin（55 mg/kg）.The hindlimbs of diabetic rats were randomly divided into compression group（group A） and loose group（group B）.In the group A， the vessels and nerves in the ankle canal of one hind limb of rats were given compression operation，while the vessels and nerves in the ankle canal of one hind limb of rats in the group B were given exploratory operation.At the same time，wounds were made on one side of feet of rats in the group A and the group B.After 6 weeks，pathological sections were taken to observe the histopathological changes of blood vessels，nerves and plantar wounds in ankle canal under microscope.Results Compared with the group B，the vascular and vascular endothelial cells in the plantar ulcer tissue of the group A significantly reduced.The expressions of vascular endothelial growth factor（VEGF），nerve growth factor（NGF） and basic fibroblast growth factor（bFGF） in plantar wound tissue of rats in the group A significantly decreased，and difference of the relative values of average optical density between the two groups was statistically significant（P<0.01）.Conclusion Tarsal tunnel syndrome can promote the development of diabetic foot lesions in rats.

【Key words】 diabetic foot;diabetic rats;tarsal tunnel syndrome

隨着糖尿病患者日益增多，糖尿病足（Diabetic Foot）患者也随之增多。踝管综合征（Tarsal tunnel syndrome）也称跗管综合征，指胫神经或其分支、终末支在内踝后下方的相应管道内受到挤压而产生的局部或足底放射性疼痛、麻木的神经综合征[1]。糖尿病足患者合并踝管综合征时病情发展变得更加复杂，此类疾病的治疗及研究鲜有报道，仅有个别文献报道提及部分糖尿病患者出现此病症状[2]。患者踝管及踝管上下存在多发神经、血管的严重病变，通过高频彩色多普勒对患者踝管处血管、神经的扫描[3]得到证实。踝管综合征如何影响糖尿病足病变发展的机制尚未清楚，因此根据糖尿病足合并踝管综合征患者病变特点设计近似实际病变的动物模型，探索病变发展过程中糖尿病足皮肤、血管、神经病变组织的病理学改变。

1 资料与方法1.1 实验设计 采取随机对照动物实验方法。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部关于善待实验动物的规章。

1.2 时间及地点 于2016年12月～2017年6月在柳州市人民医院实验中心动物实验室完成。

1.3 实验材料 SPF级6周龄SD大鼠50只，体重（20944±18.61）g。动物来源于广西医科大学实验动物中心。

1.4 实验方法 将链脲佐菌素（Streptozoticin，STZ，Sigma公司）溶于0.1 mol/L 新鲜枸橼酸/枸橼酸钠缓冲液中（pH 4.5），SD大鼠禁食12 h后按55 mg/kg剂量一次性腹腔注射1.2%STZ。于72 h时后测空腹血糖（FPG），选取FPG连续维持在16.7 mmol/L以上的SD大鼠，饲养2周后空腹采尾静脉血，以血糖分析仪测定，FPG>11.1 mmol/L为造模成功[4] 。选取其中造模成功SD大鼠40只饲养2周，按随机数字表分为卡压组（A组）与松解组（B组）各20只，予0.3%戊巴比妥钠溶液（1 mL/100 g）腹腔麻醉， A组大鼠一侧后肢踝管处血管、神经行卡压手术。为保持良好的卡压效果，自行设计切取5 mm×5 mm浅筋膜条，显微镜下显露血管、神经鞘后将筋膜条环绕一周，以显微缝线固定并环扎血管、神经3道，每道缝线间隔约2 mm。卡压成功标准：显微镜下观察神经表面动脉受压，但血流尚未完全阻断。缝合关闭切口。B组大鼠一侧后肢踝管处血管、神经行探查手术后关闭切口。同时两组大鼠手术侧足底相同部位使用直径3 mm金属棒明火加热2分钟后，直接烧灼5秒钟制备直径约3 mm足底创面。

1.5 实验标本收集及检测方法 A组、B组大鼠饲养6周，予0.3%戊巴比妥钠溶液（1 mL/100 g）腹腔麻醉，行手术侧后肢踝管处神经、血管及足底创面组织取材，标本经生理盐水冲洗后，立即使用4%多聚甲醛溶液中固定24小时，经梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，做连续切片，常规HE染色和免疫组化染色标记足底创面组织切片中的血管内皮生长因子（VEGF）、神经生长因子（NGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。免疫组化图像使用Image-pro plus 进行分析并测算平均光密度相对值。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结  果2.1 糖尿病大鼠一般情况 造模前大鼠反应良好，毛发光洁，饮食、大小便正常，行动灵敏，行STZ腹腔注射后3～7天，大鼠开始出现明显多尿、多饮、多食症状，毛发污黄，光泽度差，活动力明显降低。连续2周多次测定FPG为（20.37±4.18）mmol/L，糖尿病大鼠造模成功。

2.2 糖尿病足大鼠病变发展情况 A组大鼠术后3天出现明显的肢体肿胀，足底创面周围肿胀尤其明显。3周时A组足底创面明显扩大，且肢体肿胀明显;B组大鼠足底创面无明显扩大，肢体肿胀不明显。6周实验取材时A组大鼠足底创面不愈合，B组足底创面基本愈合。见图1。

2.3 病理学形态改变 组织切片HE染色显微镜下A组大鼠的踝管处神经组织水肿，大量单核细胞浸润，神经纤维变性;血管内皮细胞明显减少，血管内皮细胞核皱缩;足底创面组织中纤维细胞萎缩，纤维变性、细胞水肿，细胞核明显减少。B组大鼠踝管处神经、血管及足底创面组织表现为较正常的组织学结构，血管内皮细胞结构完整，神经纤维结构清晰，皮肤细胞层次清晰、结构完好。见图2。

2.4 细胞因子表达 A组足底创面组织切片免疫组化显示大鼠VEGF、NGF、bFGF表达较B组明显降低（P<0.01）。见表1和图3。

2.5 各组大鼠的一般情况 在实验过程中，A组和B组大鼠无死亡。

3 讨  论  足底皮肤是远离循环系统中心的末梢组织，糖尿病足状态下易出现不同程度的损害，组织形态学改变主要表现为皮肤变薄，损伤后易出现难愈合的皮肤溃疡。足底创面的修复需要血管再生为基础，血管内皮细胞及成纤维细胞等在细胞因子的引导下增殖、迁移到血管外周后分化成相应的组织细胞。糖尿病足大鼠踝管卡压形成后，踝管处的血管、神经卡压加重导致相应支配区域的血液及神经营养削弱，术后6周A组大鼠足底创面组织中的VEGF、NGF、bFGF平均光密度与B组比较差异有统计学意义，A组大鼠足底创面处无法生成较多的新生血管内皮细胞，皮肤成纤维细胞增殖困难，造成创面愈合困难，表现为A组大鼠糖尿病足病变发展较B组迅速，A组大鼠足底创面修复时间长且修复效果差。

VEGF是目前所知最强的血管内皮细胞选择性有丝分裂因子和血管生成因子，能够特异地直接作用于血管内皮细胞，作用包括促进新血管生成、促进血管内皮细胞增殖、提高血管通透性、改变血管外基质、维持新生血管功能，在微小血管结构和功能改变的病理生理过程中发挥重要作用[5]。VEGF在动脉闭塞病理进展及侧支循环建立新生血管的过程中起着至关重要的作用，VEGF表達提高后可以通过旁分泌介导作用促进血管内皮细胞迁移、分裂、增殖，形成新的毛细血管网。A组大鼠足底创面组织中血管内皮细胞明显减少， A组大鼠足底创面组织切片中的VEGF表达明显低于B组，A组VEGF表达水平降低导致足底创面边缘毛细血管通透性减弱，新生毛细血管再生数量及速度下降，直接影响足底创面的修复。

NGF是各类组织中常见的细胞生长调节因子，具有营养神经和促进神经生长的生物学功能，对中枢神经元和周围神经的发育、分化、生长、再生及功能特性的表达具有重要调节作用。NGF不仅可以对神经元起营养保护作用，而且具有促进神经组织以外的血管生成作用[6]。NGF表达能够为周围神经修复早期提供蛋白合成信息，使感觉神经对氨基酸和其他小分子物质摄取增加，轴浆合成、运送加速，经再生轴突运送到感觉效应器并加速其功能恢复，促进感觉结构完整性的恢复，同时促进了神经周围微血管的再生。Juliopieper等[7]通过实验证实NGF可增加VEGF的mRNA和蛋白表达水平，说明NGF能够作用于VEGF来促进内皮细胞再生并介导内皮细胞、成纤维细胞的迁移、增殖，最终形成新生血管及血管周基质。A组大鼠踝管处的神经组织中神经纤维排列明显松散，髓鞘严重厚薄不均并出现严重空泡变性，轴索变细甚至消失。A组大鼠足底创面组织中的NGF表达明显低于B组，NGF表达水平降低间接影响到新生血管的生成。

bFGF是具有多种生物活性的多肽类物质，对皮肤组织的成纤维细胞、血管内皮细胞等细胞有明显的促进分化增殖作用，在皮肤损伤后的修复过程中起重要作用。 本实验中A组大鼠足底创面组织中的细胞排列明显松散，细胞核减少并出现空泡变性，细胞层数明显减少，血管明显减少。A组大鼠足底创面中的bFGF表达明显低于B组，足底创面处的成纤维细胞、血管内皮细胞的增殖、迁移明显减少。

综上所述，糖尿病足大鼠合并踝管综合征后组织中的VEGF、NGF、bFGF表达明显降低导致足底创面不愈合，由此可见踝管综合征对大鼠糖尿病足病变的发展有明显促进作用。

参 考 文 献

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