光学显微镜应用问题故障分析与解决方案*

2019-07-01高小燕崔泽实

中国医学装备 2019年6期

姚璐高小燕△ 崔泽实

自1665年Robert Hooke用显微镜观察软木切片提出“cell”一词[1]至今已有354年的历史，再追溯到1590年Hans Jansen等研制成功第一台复式光学显微镜更为久远，可谓是一项传统的光学检测仪器技术，在其技术发展的历史进程中至少产生了3项诺贝尔奖，而借助光学显微镜从事研究获得诺贝尔奖更不胜枚举[2]。可见，光学显微镜理论与技术在不断创新，特别是近代光学、微电子、计算机、材料科学等综合科技发展与传统光学显微镜技术融合，不断提升其应用功能与观测能力，仍以较高的技术利用效率活跃在医学、工业、农业等相关领域，推动着多学科的生成与进步。因此，优化规范光学显微镜的操作技术流程，及时排除应用故障是其技术保障体系研究的重要课题。

1 资料与方法

1.1 期刊文献数据挖掘

分别以“显微镜”与“应用”、“故障”及“问题”组合，形成多重检索路径对中国知网(CNKI)、万方数据知识服务平台(WANFANG DATA)及维普期刊资源整合服务平台(VIP)进行中文文献检索，检索时间设为起始日期不限至2018年12月31日。

1.2 文献计量与可视化分析

对检出文献列表进行查重，并下载样本文献，进行常规文献计量学分析；经文献复习提取光学显微镜应用问题故障词，构建词-篇共现矩阵；利用明尼苏达大学图形聚类工具包(graphical clustering toolkit，gCluto)对其进行双聚类可视化分析，分析我国期刊光学显微镜应用技术研究的聚焦专题[3]。

1.3 显微镜应用问题故障分析

根据文献计量学与可视化分析结果，对高频故障术语项进行故障树分析(fault tree analysis，FTA)[4]与根本原因分析(root cause analysis，RCA)[5]；并提出相应优化解决方案。

2 结果

2.1 文献计量

经剔除重复文献及无有效数据可采集的文献，共获得样本文献172篇。

(1)文献年代分布。文献分布期刊见图1。

(2)文献类别分布。172篇文献分布在84种期刊，其中刊文数≥4篇的期刊有13种(刊文92篇，占样本文献总数的53.49%)，见表1；22种为中国科技核心期刊，刊文58篇[6]。

图1 光学显微镜应用故障文献年代分布

表1 刊文数≥4篇期刊

2.2 问题故障词

在获得的164个关键词中，经剔除宽泛词，合并同义词，最终确定为126个(见表2)；在样本文献中出现频次较高的关键词，能够反映该领域研究关注的热点。

表2 光学显微镜期刊文献应用问题故障词

2.3 双聚类可视化分析

将126个应用问题故障词与172篇文献形成的词篇共现矩阵，带入gCluto软件进行双向聚类，根据聚类效果确定为5类。可视化矩阵图及山丘图见图2。

注：图中a为可视化矩阵图；b为可视化山丘图

双聚类可视化分析结果表明，我国中文期刊文献中关于光学显微镜应用问题与故障的研究报道主要聚焦在4个方面：①与光学显微镜的光学器件及相位差、偏光、微分干涉相位差(differential interference contrast，DIC)等特殊镜检技术功能器件的设置、光路调整与样片制备相关问题(0类)；②镜像模糊涉及的光学器件污染、机械故障、常规保养维护问题(1类)；③荧光镜检与数字显微摄影故障(2类)；④显微镜照明系统的调设问题与控制电路故障。

3 讨论与分析

3.1 设置与调节问题

光学显微镜是借助各种光学器件利用光波的透过、吸收、反射、衍射、折射等特性完成镜像观测的光学仪器，因此光学系统及相关功能器件的优化设置与调节是保证镜像效果的首要技术环节。

0类中“光阑调节、聚光镜光轴偏离、数值孔径(numeric aperture，NA)值不对应、覆盖差、视场照明不均、有效放大、屈光调节、蓝色滤光片、镜像偏色、相位差调节、DIC效果差”等高频词显现出光学显微镜的设置与调节的若干问题，沿光学路径进行故障分析，探讨解决方案。

3.1.1 视场照明不均

从光源到目镜或(charge-coupled device，CCD)芯片导致视场照明不均涉及的光学器件及其应用问题，RCA见图3。

图3 视场照明不均RCA鱼骨图

(1)灯丝对中问题。卤素灯的灯丝中心点必须对准光轴中心才能使其照明强度发挥最佳，如灯丝中心点偏离则影响照明效果，导致视场照明不均，甚至半明半暗。预定中心光源设计，有效解决了灯丝中心偏位问题；但如使用非预定中心光源机型，或出现：①过度振动；②安装灯泡时，插脚未精准到位；③使用非标灯泡；均会导致灯丝中心偏离。

排除②、③因素后，需要做灯丝像中心校准，步骤为：①缩小视场光阑，在视场光阑处放置乳白磨砂滤光片或一张硫酸纸，即可见灯丝像和缩为点状的视场光阑像呈现；②利用灯箱外方的3个调节螺杆进行调节，其中一个可调整灯泡聚焦使灯丝像清晰，如点状视场光阑像不在灯丝中央，则用其他2个螺杆做上下、左右调整。

(2)吸热滤片问题。在灯箱出射光路上置有1个磨砂或乳白色滤片，起到吸收光热及杂散光的作用，即可防止过热辐射损坏光学器件的精密镀膜，同时使光线变为均一、柔和；如将其移出光路，照明则显现有眩光，导致视场不均现象。常发生在使用者因照明亮度不足，误将吸热滤片移出光路。

(3)反光镜偏位。根据镜检方法不同涉及有几组反光镜，一般情况下不会偏位，在极度振动、意外触碰的情况下可能发生。如难以纠正，需联系厂家工程师。

(4)聚光器偏离光轴。指聚光镜中心偏离视场出射的准直光轴，在非定中心聚光镜或定中心聚光镜经长期使用或受外力影响的情况下发生。校准方法：①在明场镜检下，用10×物镜观察样本并完成调焦；②将视场光阑尽量缩小，聚光镜孔径光阑开至最大，在镜场内可见到视场光阑像(如视场光阑像不清晰，可稍微调节聚光镜的升降螺旋进行聚焦)；③如后者不在视场中央，则交替旋调聚光镜外侧的2个调中螺杆将其调至中央部分；④逐渐开大视场光阑，直至其与镜场对称内接，则表明聚光镜与显微镜光路达到合轴；⑤将聚光镜升至原位。

(5)物镜转换器错位。在安装或清理物镜时卸下转换器后，再安装时定位不准。处理方法是先拧松固定螺丝，重新滑动燕尾槽准确对位。

3.1.2 NA值对应调节问题

系指聚光镜NA要根据镜检当下所用物镜的NA作对应调节，每当转换一个倍率物镜均需调节，是一普遍被使用者忽视的问题。进入物镜孔径角(光轴中心上聚焦的物像点与物镜前透镜有效直径所形成的角度)的光学信息量决定了显微镜的分辨率(D=λ/NA)，聚光镜的主要作用是根据物镜NA提供相应大小的光锥照明。如果开得过大，将浪费一部分光线；开得过小，则未能充分利用物镜孔径角的通光量；两者结果均可使分辨率降低。对应调节的原则是：①观测镜检时，对应比率为80%～100%；②显微摄影时建议在60%～80%或70%～80%间调节，以获得最佳反差。

3.1.3 有效放大

表达式为：有效放大=所用物镜的NA值×500-1000[7]；在同放大倍率范围内，组合不同倍率的物镜和目镜得到不同镜像分辨率[8]；为保证分辨率应首选高倍、大NA的物镜，而不要一味追求目镜放大。近代用虚拟切片技术制作显微镜像数字资源库、远程病理等项目则是遵循有效放大原则[7]。

3.1.4 覆盖差

要界定两组国际标准数据：①盖玻片0.17 mm，载玻片1.0 mm；②透射照明时聚光镜前透镜上限位于载物台平面下方0.1 mm，聚光镜焦点在其上方1.25 mm处，要保证被检样品在焦点上才能获得最佳镜检效果。在此标准范围外将产生覆盖差，覆盖差大于标准则光程长，透过样品的出射角度偏离(小)，光不能完全对应物镜孔径角，分辨率下降；反之，覆盖差小于标准，光程短，出射角大，相当一部分光投射到孔径角以外，未被物镜NA所利用，也影响分辨率。因此，要精密控制制片厚度，选择标准的载玻片和盖玻片。在一定的覆盖差范围内，可以使用带覆盖差校正环(correction collar，CC)的物镜进行校正[9]。方法是：先旋调CC将0.17数值标线对准定位刻线，分别向左右方向调节直至镜像达最佳，且要坚持每当更换标本时作复核调节。

3.1.5 镜像偏色

有2个主要影响因素：①样片制备过程染料残留底色，可遵循光色互补原则加色温补偿滤片消除；②色温影响，光源色温应控制在5500 K。纠正方法是要将蓝色色温平衡滤光片置入光路，其次调节照明电压(一般为9 V)，有条件可配合色温计使用精准调节，如镜像过亮刺眼，可置入相应的ND滤片，后者并不改变色温。

3.1.6 相差效果不佳

(1)相差镜检。利用透过观测样本的直射光与所产生的衍射光在光程上的相位差转换为振幅差，通过制造不同程度的光学干涉效果达到观测不染色样本的目的。故障原因多发生在相差装置与相差物镜的对应调整环节。解决方案是：①确定聚光镜对中；②用勃特兰调焦镜逐一检查所用物镜的相位板(位于物镜后焦面)与安装在聚光镜转盘上对应倍率的相差环是否达到光学共轭[8，10]。

(2)DIC镜检。事先做好起偏镜、检偏镜与各倍率DIC棱镜调置，用勃特兰调焦镜检测出清晰的干涉条纹。样本或器皿要洁净无尘，使用封片剂要均匀。做荧光观察时，要把DIC器件移出光路。

(3)霍夫曼调制相差(Hoffman modulation contrast，HMC)镜检。也有称整合调制相差(integrated modulation contrast，IMC)，调节方法基本同DIC。

3.1.7 屈光度调节

此项操作极易被忽略，以致使用中发生眼疲劳。如果配置的物镜齐焦，常用操作步骤是：先调整好瞳距，用右侧目镜观察完成对焦，而后改用左测目镜观察，调节目镜筒配置的屈光度校正环直至调焦清晰。

3.2 镜像模糊问题

镜像模糊是镜检中最常见的镜像质量问题，多数文献不同程度涉及。聚类分析1类中“透镜生霉生雾、光学器件污染、粗细调焦螺旋问题、视场异物、浸油气泡、成像质量低”等词的高频聚积反映出镜像模糊结局。问题原因主要与显微镜的常规维护及使用环境相关。

3.2.1 常规维护

对光学显微镜应贯彻预见性维护与预防性维护结合的原则。

(1)预见性维护。要针对显微镜常见问题的关键点坚持在使用前后进行维护，如聚光镜中心监测等。

(2)预防性维护。至少1个月1次，对光学部件及机械部件做系统清理、擦拭，避免用有机溶媒擦拭镜体涂漆部分及机械部件。

(3)常规与使用后维护。①用吹风球类吹塑工具(如洗耳球)除去光学部件表面灰尘；②物镜、目镜的清理，用擦镜纸蘸取适量擦镜液(乙醚和乙醇7∶3配制的混合液)由内向外螺旋跟进擦拭，而后用干擦镜纸擦，再用吹风球吹干，对≥40×物镜前透镜，要使用质地较软的木牙签或类似物体磨钝尖端包上至少两层擦镜纸蘸擦镜液轻擦，不能用坚硬的竹牙签，以免牙签透过擦镜纸划伤透镜面；③控制物镜沾染，油浸系或水浸系物镜在使用后，要立即清擦，倒置显微镜用油浸系物镜更要及时处理，以免油渗入透镜组，同时检查相邻的其他倍率物镜是否在转换时沾染上镜油，另浸油中有气泡将导致折射率改变，影响分辨率[11]；④特殊光学镀层光学部件，如偏光镜检的起偏镜及检偏镜、DIC棱镜、荧光激发发射滤光片组件、CCD芯片等，一旦发现有灰尘颗粒首选用吹风球吹朔，如不奏效，可试涂洁净的液态胶类物质，待其干后揭去，粘除污物；⑤去除样片沾染同样是不可忽视的环节，在显微摄影时镜像质量不高，也要考虑是否清除了制片环节在盖玻片、载玻片上的沾染物，如染色剂、封片剂、手印等。

3.2.2 使用环境控制

强调要落实“六防”措施[12-13]。

(1)防灰尘。防尘是安装使用光学检测仪器的特定要素，灰尘混入显微镜光路会产生额外的光散射、衍射效应，障碍分辨能力发挥，灰尘在光学器件上或样片上积聚也将导致镜像模糊。除控制空间环境清洁外，显微镜不要安放在邻近窗户、门口或其他风道位置。

(2)防潮湿。透镜生霉生雾主要是环境潮湿所致，要监测室内温湿度，定期开机，更不能把显微镜安装在水池或地漏旁，暂不使用的物镜等光学器件可放入干燥罐中保存(但要定期更换干燥剂)。有条件情况下，在室内安装除湿机，在显微镜中放置防霉片(要定期更换)。霉点清除方法同常规维护。

(3)防振动。防止振动的2个主要环节。①安装位置远离振动源，台面水平、稳定，必要时配置专用防振台，配套计算机最好不要与显微镜放在一个台面上，且2台显微镜间要留有空隙以防联动；②操作过程无振动，特别是在图像采集的曝光时间内、显微操作、显微切割等精密操作环节。

(4)防腐蚀。显微镜实验室内禁放腐蚀性、挥发性试药。

(5)防高温。膨胀系数变化可引起镜片的开胶或脱落，也将改变透镜、浸油的折射率，影响物镜NA性能乃至分辨率[14]。

(6)防干扰。①强光或眩光干扰，混入显微镜光传递路径中会影响镜检质量；②电磁干扰，不仅影响环境稳定，还会影响显微镜配置的传感器件、CCD成像装置以及激光共聚焦扫描显微镜等的性能。

3.2.3 机械故障问题

(1)粗细调焦螺旋问题。粗调焦螺旋过紧或过松，过紧时，转动调焦螺旋困难；过松时，会发生已调好的镜筒自行下滑一段距离，物像不清晰，也易碰碎玻片。因此，必须调整其松紧度达最合适状态，可用左手握紧左侧的粗调焦螺旋，右手按顺时针方向转动右侧的粗调焦螺旋，升降做紧固调节，如果向逆时针方向转动可使之变松，不要随意搬动锁定装置。

(2)物镜转换器问题。排除物镜转换器错位，常见故障发生在轴承和弹簧片。

(3)X-Y载物台移动过紧或过松。可通过调节同轴螺杆手柄上端的张力控制螺旋解决。

3.3 荧光镜检与数字显微摄影问题

荧光观测是光学显微镜技术发展最活跃的领域，聚类分析2类中，“荧光光路对中、量子效率、荧光电源故障、白平衡调节、像素矩阵、暗电流”等词集中反映了使用中备受关注的问题。

3.3.1 荧光镜检问题与故障

(1)亮度不均。呈现为区域性规则的部分明亮、部分暗淡或中心明亮外周暗，在使用汞灯为激发光源时的主要原因是：①荧光照明光路不对中，实质上是灯两极间弧光的实像与反光镜所反射的弧光反射像未调至两像大小相近均匀对称、合弧，并对准照明光路中轴，调节相比于卤素灯照明复杂，可参照操作说明书按步骤调整[15-16]；②荧光照明视场对中偏移，可借助2个螺旋杆对视场光阑像进行聚中调节；③排除ND滤片、DIC棱镜及荧光激发发射组件错位遮挡。

(2)荧光强度与量子效率。荧光量子效率(fluorescence quantum efficiency，QEf)=发射量子数/吸收量子数)，而荧光强度(If)=QEfI0(1-It/I0)。可见，保证足以镜检与测量的荧光强度，涉及3个指标：①具备足够强度的激发光源，且要根据所用荧光染料或样本自发荧光的激发与发射波长特征选择合适的荧光光源及合适带通的激发/发射组件；论文中常将实际镜检所用荧光激发/发射组件波长与荧光染料激发/发射波长相混淆表述，也是值得注意的问题[17]；②配置合适QE的发射波长检测器件，要根据CCD的QE相应曲线予以评估；③控制精准好样本制备与检测环境体系，保证QEf≥0.4。

(3)物镜配置。尽量配置高等级、大NA物镜，因为：①镜像亮度=NA物镜/放大倍率，与物镜NA2成正比；②抑制衍射斑(模糊圈)能力强。还要考虑物镜材质特性，如Ca2+浓度测定[18]要选用UV物镜。配置带光阑调节的物镜，可控制杂散光干扰。

(4)常见故障与排除。①“汞灯暗淡”，标定有效强度寿命是200工作小时，而后则强度逐渐减低，应适时更换；②光源不启动(开机后启动指示灯不亮或闪烁几下后熄灭)，要排除环境温度过低及电源电压不稳等因素，最好配置净化稳压电源；③电气故障：安卫东等[19]报道了由于使用者安装汞灯不当造成阳极与机壳间短路、荧光电源保险系熔断、整流桥电阻击穿、空气开关跳闸以及电源装置嗡嗡作响、汞灯变暗、镇流器匝间短路的案例；单维卿[20]在对荧光电源电路深入分析的基础上，找出了由于高压二极管出现过载而击穿、整流电路短路、高压变压器烧坏故障。

(5)维护。①频繁启动会造成汞灯损坏，使用原则是在打开光源电源后，需等2～3 min输出激发光趋于稳定再进行镜检，关闭电源要在汞灯工作15 min后方可；一旦关闭必须等15～30 min(视室温)，待汞灯冷却，汞蒸汽凝结后再开启；②激光共聚焦扫描显微(laser scanning confocal microscopy，LSCM)的氩离子激光器也要遵循此原则。

3.3.2 数字显微摄影问题

针对数字CCD显微摄影(photomicrography)常见问题，质量控制重点如下。

(1)严格落实环境控制“六防”要求，且在显微摄影时周边不要有他人走动。

(2)完成光路及样片清理、光轴对中调节等质量控制步骤。

(3)摄影光学接口倍率选择要在遵循有效放大原则基础上与CCD成像面积兼容。

(4)数字CCD配置。①组化、HE成像，要统筹考虑成像速度、预览速度、像素大小、像素矩阵、成像面积等因素；②荧光摄影，在兼顾①基础上，重点考虑QE、暗电流、满井容量等指标，暗电流是影响荧光图像采集质量的重要因素，与CCD工作温度成反比，因此荧光成像首选制冷CCD，满井容量是指每个像素单元所能容纳的最大电荷数，对微弱荧光需长时间曝光，如果满井容量过小，在曝光时间不足时即出现电子溢出，影响准确采集图像，选择满井容量大为宜[21]；③在进行荧光强度测量等特定情况下要评估像素大小、像素矩阵指标与灵敏度指标的相互关系；④组化、HE成像多数情况下采用彩色CCD，而荧光成像首推单色CCD。

(5)测光。控制装置或程序要具备点测光功能，使用时不要忽略根据目标采集物像区域进行反复选择测量，以获得最优化图像。

(6)白平衡。白平衡测量要选择最能代表样片背景的区域，反复做直至满意为止。

(7)黑平衡。主要用于荧光摄影，以荧光图像背景操作，得到背景黑暗、物像明亮效果为宜。

(8)视场光阑的调节配合。可调节视场光阑像至CCD成像区域外缘，以最大限度的屏蔽区域外杂散光的干扰。但不要缩得过小，以免造成矩形成像框角切迹[22]。

(9)LSCM图像采集要掌控物镜NA、针孔大小、PMT增益以及背景水平和图像亮度之间的协同优化，激光功率尽可能小[23]。