心肌缺氧状态下间充质干细胞对巨噬细胞M2极化的影响及其机制研究*

彭智勇，赵吉玲，张烨，余国龙

（中南大学湘雅医院 心内科，湖南 长沙 410008）

目前已经明确单核细胞/巨噬细胞参与急性心肌梗死（以下简称心梗）炎症反应、炎症损伤、抗炎反应及组织修复的多重效应[1]。其主要通过M1 和M2型巨噬细胞发挥作用[2-4]。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）是从骨髓中分离出来的成纤维细胞样细胞，有研究证实MSC 移植治疗急性心梗疗效显 著[5-6]。其主要作用机制并非心肌细胞再生，而是旁分泌机制对心梗炎症心肌损伤、促心脏修复双重效应的调节[7]。MSC 有促巨噬细胞M2 亚型极化的作用，体外MSC 对M2 亚型单核/巨噬细胞极化研究均非心肌细胞缺血、缺氧状态下进行，且目前MSC 对巨噬细胞M2 极化机制缺乏相关报道。

1 材料及方法

1.1 材料及仪器

RAW264.7 小鼠M0 型巨噬细胞（中国科学院上海细胞生物学研究所），C57BL/6 小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），ST2825（美国MCE 公司），蛋白定量试剂盒、RIPA 裂解液及5-BrdU 均购自美国Sigma 公司，CD11c-PE、CD206-PE 及Flow Cytometry Staining Buffer 均购自美国eBioscience 公司，诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）-Alexa Fluor® 594（美国BioLegend 公司），精氨酸酶-1（Arginine 1,Arg-1）、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）、抗-iNOS抗体、抗-Liver Arginase 抗体[EPR6671（B）]、抗Toll样受体2（Toll-like receptor 2,TLR2）抗体[EPR20303]、抗Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）抗体、抗-MyD88 抗体、抗-核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）、p65（phospho S536） 抗体、抗-IKK α+IKK β（phospho S180+S181） 抗体、抗-JNK1+JNK2（phospho T183+Y185） 抗体、抗-p38（phospho Y182）抗体、抗-ERK1（phospho T202）+ERK2（phospho T185） 抗体（EPR19401）、抗-β Actin 抗体（mAbcam 8226）-Loading Control（HRP）及山羊抗-兔IgG H&L（HRP）均购自英国Abcam 公司，电化学发光（Electrochemiluminescence,ECL）超敏发光液（美国Thermo 公司），Trizol（美国Invitrogen 公司），One Step SYBR® PrimeScript™ RTPCR Kit 试剂盒（日本TaKaRa 公司），二氧化碳培养箱（美国Thermo Forma 公司），流式细胞仪（美国BD公司），PCR 仪（美国Bio-Rad 公司），倒置显微镜（日本奥林巴斯公司），冷冻高速离心机（美国贝克曼 公司）等。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞获取、培养和鉴定 75%酒精消毒新生C57BL/6 小鼠皮肤，开胸取出心脏。根据夏机良等[8]方法获取心肌细胞，将心肌细胞悬液均匀接种至6 孔板中，2 ml/孔，放入37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中。前48 h 需要在培养液中加入0.1 mm 5-Brdu，抑制成纤维细胞增殖。取培养7 d 细胞进行鉴定，心肌细胞形态呈梭形或多边形，且免疫荧光染色后胞浆中可见清晰的a-SA 抗体染色的黄绿色肌丝。

1.2.2 无糖无氧（oxygen glucose deprivation,OGD）培养心肌细胞上清液 将心肌细胞培养基换作无糖培养基，持续高流速通入无氧气体（95%氮气N2+5%CO2）5 min 后，密封于罐中，置于培养箱中3 h，收集OGD 培养的心肌细胞上清液。

1.2.3 MSC 培养与鉴定 ①MSC 获取、培养、鉴定：取6～8 周C57BL/6J 小鼠，脱颈处死，根据李鲁生等[9]方法分离MSC，隔日换液，取P3 代细胞用于实验。采用流式细胞仪检测样本，Flowjo 分析软件进行数据分析。流式细胞仪检测MSC 细胞表面标志物CD44、CD90 阳性率＞95%，CD11b、CD34 及CD45 阴性率＞95%，方可作为实验细胞。②巨噬细胞培养：RAW264.7 小鼠M0 型巨噬细胞置于37℃、5%CO2细胞培养箱中，用含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM）高糖细胞培养基培养。每3 天用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞进行传代，取对数生长期的细胞进行 实验。

1.2.4 实验分组及细胞处理 ①M0 组：将1×106个 RAW264.7 小鼠M0 型巨噬细胞接种于6 孔板中，常规培养24 h。②M0+OGD 组：将OGD 培养的心肌细胞上清液加入到6 孔板常规培养的RAW264.7 小鼠M0 巨噬细胞中，继续培养24 h。③M0+OGD+MSC组：在M0+OGD 组基础上，加入含10% 胎牛血清、DMEM/F12培养基的1×106个MSC，培养24 h。④M0+OGD+不同浓度髓样分化因子88 组：在M0+OGD 组基础上，分别加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖细胞培养基稀释50、100 及200μmol/L 浓度的髓样分化因子88 抑制剂，培养24 h 后分为M0+OGD+50μmol/L ST2825 组、M0+OGD+100μmol/L ST2825 组及M0+OGD+200μmol/L ST2825 组。

1.2.5 流式细胞术取0.25% 胰蛋白酶消化RAW264.7 巨噬细胞，1 000 r/min 离心5 min 收集细胞，Flow Cytometry Staining Buffer 重悬细胞。计数并调整细胞浓度至1×107个/L。取100μl 细胞悬液加入2μl CD11c-PE、iNOS-Alexa Fluor® 488、Arg-1 偶 联FITC 或CD206-PE 抗体。4℃避光孵育30 min。加入1 ml 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS），1 000 r/min 离心5 min，清洗细胞，加500μl PBS 重悬细胞上机检测，利用Flowjo 软件分析结果。

1.2.6 Western blotting 检测 RIPA 裂解液裂解巨噬细胞，提取细胞总蛋白。采用蛋白定量试剂盒按说明书操作测巨噬细胞总蛋白浓度。等量蛋白以10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶120 V 电泳1 h，以350 mA 转移至聚偏二氟乙烯膜，持续70 min。用含5%胎牛血清蛋白的TBST 溶液封闭1 h 后清洗2 或3 次。4℃环境下轻摇孵育抗iNOS、抗Arg-1、抗TLR2、抗TLR4、抗髓样分化因子88、抗p65、IKKα/β、JNK1/JNK2、p38 及ERK1/2 一抗过夜。第2 天TBST 清洗2 或3 次后，室温孵育山羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗1 h。同时，孵育β-actin 抗体作为内参。采用ECL 超敏发光液显色。

1.2.7 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR） 使 用Trizol提取巨噬 细胞总RNA。采用One Step SYBR® Prime Script™ RT-PCR Kit 试剂盒逆转录合成cDNA 第一链并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）作为内参，RT-PCR 检测M1型巨噬细胞标志物TNF-α、iNOS 及IL-1β，M2 型巨噬细胞标志物IL-10、TGF-β1mRNA 水平。见表1。

表1 PT-PCR 引物序列

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 和GraphPad 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，两两比较用Bonferroni 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 M0 组与M0+OGD 组M1、M2 型巨噬细胞比例比较

M0 组与M0+OGD 组M1 型巨噬细胞比例分别为（4.63±0.51）%和（40.77±2.26）%，经t检验，差异有统计学意义（t=-27.008，P=0.001），M0+OGD 组高于M0 组。M0 组与M0+OGD 组M2 型巨噬细胞比例分别为（2.50±0.14）%和（2.38±0.18）%，经t检验，差异无统计学意义（t=0.906，P=0.416）。见图1。

图1 M0 组与M0+OGD 组流式细胞图

2.2 M0+OGD 组与M0+OGD+MSC 组M1、M2型巨噬细胞比例比较

M0+OGD 组与M0+OGD+MSC 组M1 型巨噬细胞比例分别为（68.47±2.67）%和（41.98±7.84）%，经t检验，差异有统计学意义（t=5.544，P=0.019），M0+OGD+MSC 组低于M0+OGD 组。M0+OGD 组与M0+OGD+MSC 组M2 型巨噬细胞比例分别为（9.80±0.64）%和（16.11±1.49）%，经t检验，差异有统计学意义（t=-6.749，P=0.009），M0+OGD+MSC组高于M0+OGD 组。见图2。

图2 M0+OGD 组与M0+OGD+MSC 组流式细胞图

2.3 M0+OGD 组 与M0+OGD+MSC 组iNOS、Arg-1 表达比较

Western blotting 检测结果显示，M0+OGD 组与M0+OGD+MSC 组M1 型巨噬细胞标记iNOS 相对表达量分别为（4.47±0.12）和（1.03±0.12），经t检验，差异有统计学意义（t=35.093，P=0.000），M0+OGD+MSC 组低于M0+OGD 组。M0+OGD 组 与M0+OGD+MSC 组M2 型巨噬细胞标记Arg-1相对表达量分别为（1.01±0.11）和（1.84±0.13），经t检验，差异有统计学意义（t=-8.413，P=0.001），M0+OGD+MSC 组高于M0+OGD 组。见图3。

2.4 M0+OGD 组与M0+OGD+MSC 组TNF-α、IL-1β、IL-10 及TGF-β1 mRNA 表达比较

图3 iNOS 和Arg-1 蛋白的表达

RT-PCR检测结果显示，M0+OGD组与M0+OGD+MSC 组TNF-αmRNA 相对表达量分别为（2.33±0.70）和（0.97±0.12），IL-1βmRNA 相对表达量分别为（1.68±0.12）和（1.00±0.11），经t检验，差异有统计学意义（t=7.211 和-17.399，P=0.002 和0.000），M0+OGD+MSC 组低于M0+OGD 组。M0+OGD组与M0+OGD+MSC 组IL-10 mRNA 相对表达量分别为（1.0±0.17）和（1.77±0.19），TGF-β1mRNA 相对表达量分别为（1.0±0.54）和（1.43±0.18），经t检验，差异有统计学意义（t=-5.249 和-3.967，P=0.006 和0.044），M0+OGD+MSC 组高于M0+OGD 组。见图4。

图4 各组TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β1 mRNA 相对表达量比较

2.5 不同浓度髓样分化因子88 抑制剂组M1、M2 型巨噬细胞比例比较

不同浓度髓样分化因子88 抑制剂组M1 型巨噬细胞比例比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；M0+OGD 组高 于M0+OGD+50μmol/L ST2825 组（P＜0.05）；M0+OGD+50μmol/L ST2825 组高于M0+OGD+100μmol/L ST2825 组（P＜0.05）；M0+ OGD+100μmol/L ST2825 组高于M0+OGD+200μmol/L ST2825 组（P＜0.05）。不同浓度髓样分化因子88 抑制 剂组M2 型巨噬细胞比例比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；M0+OGD 组低于M0+OGD+50μmol/LST2825 组（P＜0.05）；M0+OGD+ 50μmol/L ST2825 组低于M0+OGD+100μmol/L ST2825 组（P＜0.05）；M0+OGD+100μmol/L ST2825组低于M0+OGD+200μmol/L ST2825 组（P＜0.05）。见图1和表2。

2.6 不同浓度髓样分化因子88 抑制剂组iNOS、IL-10 mRNA 表达比较

不同浓度髓样分化因子88 抑制剂组iNOS mRNA相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；M0+OGD 组高 于M0+OGD+50μmol/L ST2825 组（P＜0.05）；M0+OGD+50μmol/L ST2825 组 高于M0+OGD+100μmol/L ST2825 组（P＜0.05）；M0+ OGD+100μmol/L ST2825 组高于M0+OGD+200μmol/L ST2825 组（P＜0.05）；不同浓度髓样分化因子88 抑制剂 组IL-10 mRNA 相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；M0+OGD 组低于M0+ OGD+50μmol/L ST2825 组（P＜0.05）；M0+OGD+ 50μmol/L ST2825组低于M0+OGD+100μmol/L ST2825 组（P＜0.05）；M0+OGD+100μmol/L ST2825 组低于M0+OGD+200μmol/L ST2825 组（P＜0.05）。 见 表2和图5。

2.7 各组TLR2、TLR4、髓样分化因子88 及磷酸化蛋白相对表达量比较

各组TLR2、TLR4 蛋白相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。M0 组低于M0+OGD 组 和M0+OGD+MSC 组，与M0+OGD 组高于M0+OGD+MSC 组（P＜0.05）。各组髓样分化因子88 蛋白相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。M0 组低于M0+OGD 组和M0+OGD+MSC 组，而M0+OGD 组高于M0+OGD+MSC 组（P＜0.05）。各组p-P65、p-IKKα/β、p-JNK1/2、p-P38 及p-ERK1/2 蛋 白 相 对 表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。M0 组低于M0+OGD 组和M0+OGD+MSC组，而M0+OGD 组高于M0+OGD+MSC 组（P＜0.05）。见表3和图6。

表2 各组iNOS mRNA、IL-10 mRNA 及M1、M2 型巨噬细胞比例比较 （±s）

表2 各组iNOS mRNA、IL-10 mRNA 及M1、M2 型巨噬细胞比例比较 （±s）

组别 iNOS mRNA IL-10 mRNA M1/% M2/%M0 组 1.02±0.10 1.34±0.27 4.63±0.51 2.50±0.14 M0+OGD 组 15.6±1.47 1.00±0.36 40.77±2.26 2.38±0.18 M0+OGD+50μmol/L ST2825 组 11.5±1.21 2.43±0.93 29.39±1.83 4.73±0.39 M0+OGD+100μmol/L ST2825 组 8.34±1.14 3.57±0.20 17.10±0.89 7.24±0.30 M0+OGD+200μmol/L ST2825 组 5.59±0.63 7.13±0.29 9.75±0.67 14.0±0.59 F 值 87.317 432.208 326.988 547.400 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

图5 各组iNOS mRNA、IL-10 mRNA 水平比较 （±s）

表3 各组TLR2、TLR4、髓样分化因子88 及磷酸化蛋白相对表达量比较 （±s）

表3 各组TLR2、TLR4、髓样分化因子88 及磷酸化蛋白相对表达量比较 （±s）

组别 髓样分化因子88 TLR2 TLR4 p-P65 p-IKKα/β p-JNK1/2 p-P38 p-ERK1/2 M0 组 1.00±0.12 1.01±0.92 1.02±0.18 1.00±0.31 1.00±0.09 1.00±0.04 1.00±0.20 1.00±0.08 M0+OGD 组 5.11±0.19 4.89±0.28 3.81±0.38 6.18±0.89 10.00±0.37 7.00±0.30 7.64±0.89 5.06±0.30 M0+OGD+MSC 组 3.19±0.48 2.91±0.60 2.73±0.33 4.68±0.61 6.64±0.45 5.13±0.63 4.85±0.53 3.06±0.42 F 值 134.221 75.158 61.692 54.715 531.534 89.982 133.017 171.899 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图6 各组TLR2、TLR4 和髓样分化因子88 蛋白表达以及下游信号通路磷酸化水平

3 讨论

MSC 促进心内巨噬细胞M1 向M2 亚型转化效应近期得到初步肯定。2011年DAYAN 等[10]通过结扎大鼠冠状动脉左前降支复制心梗模型，对大鼠心梗后模型心肌注射MSC，与对照组相比，免疫荧光分析MSC 治疗组心肌中检测到Arg-1 强表达。2009年KIM 等[11]研究发现，将MSC 和巨噬细胞体外共培养可以促进巨噬细胞转化为M2 型，其细胞高表达CD206。2013年ABUMAREE 等[12]研究进一步证实MSC 可以促进M1 型巨噬细胞转化为M2 型，研究者将单核细胞在加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的培养基中培养7 d，成功地将单核细胞定向分化为M1 型巨噬细胞，再与MSC 共培养3 d，通过流式细胞术发现其CD14、CD36、CD163、CD204 及CD206 等M2 型细胞表型增加。以上研究均在非心肌细胞缺血缺氧状态下进行。本实验在以OGD 处理的心肌细胞培养基上清液模拟心肌缺氧状态下进行，结果显示，与M0组比较，模拟心肌缺氧状态下成功诱导M1极化；再与MSC 共培养促进M1 极化向M2 转化。

Toll 样受体是细胞膜结合模式识别受体，是机体细胞免疫中的关键受体（包括单核细胞/巨噬细胞等炎症细胞），在天然免疫和获得性免疫中起核心作 用[13]。梗死心肌细胞内损伤信号分子激活炎症细胞Toll 样受体信号通路，诱导产生细胞因子和趋化因子表达上调（包括单核细胞/巨噬细胞等炎症细胞），促进炎症的发生和发展[14-15]。TLR2 和TLR4 是Toll 样受体家族中的重要亚型，其主要参与梗死后心肌的炎症反应[16]。髓样分化因子88 是Toll 样受体信号传导通路的一个关键分子，是多种受体信号下游传导的核心环节。Toll 样受体下游信号通路中髓样分化因子88依赖的细胞NF-κB 和丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）信号通路的激活在炎症介质的释放及免疫调节过程中发挥重要作用[17-20]。 本研究结果表明，OGD 培养的心肌细胞上清液诱导M0 巨噬细胞极化成M1 型，且TLR2、TLR4 及髓样分化因子表达上升，TLR2、TLR4 及髓样分化因子88 下游的NF-κB 和MAPK 信号通路标记分子P65、IKKAα/β、JNK1/2、P38 及ERK1/2 磷酸化水平增加；加入MSC 共培养后TLR2、TLR4 及髓样分化因子88表达下降，且其下游的NF-κB 和MAPK 信号通路标记分子P65、IKKAα/β、JNK1/2、P38 及ERK1/2 的磷酸化水平下降。

综上所述，本研究证实MSC 调节巨噬细胞亚型之间转化的机制之一是通过抑制TLR2、TLR4 及髓样分化因子88 下游的NF-κB 和MAPK 信号通路，进一步认识MSC 治疗急性心梗抗炎与促进心脏修复的机制，为今后研究巨噬细胞亚型转化参与组织抗炎与组织修复提供新的理论依据与干预靶点。