血清microRNA-4286表达与胃癌临床病理特征的关系及其临床意义*

郭红艳，高勇，张春晶，李淑艳，吴琦，黄常志，孙晓杰

（1.齐齐哈尔医学院 生物化学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院第三 附属医院 检验科，黑龙江 齐齐哈尔 161002；3.中国医学科学院北京协和医学院 肿瘤医院 分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021）

胃癌是世界第3 大癌症死亡原因，约50%胃癌发生在中国，且年轻患者死亡率呈逐年上升的趋势[1-2]。 microRNAs（miRNAs）与人类肿瘤的发生、发展关系密切，是新型基因诊断标志物[3-4]。MicroRNA-4286（miR-4286）定位于人类染色体8p23.1，在恶性黑色素瘤等肿瘤组织中表达上调[5-6]，但miR-4286 在胃癌中的表达及其与胃癌发生、发展的关系国内外却未见报道。本文通过实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）检测胃癌血清样本中miR-4286 的表达，分析其与胃癌临床病理特征的关系，初步探讨其对胃癌的临床诊断效能及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年3月—2017年6月在中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院住院的胃癌患者（胃癌组，84 例）和健康体检者（对照组，60 例）。其中对照组男性19 例，女性41 例，平均年龄（48.71±10.53）岁；胃癌组男性66 例，女性18 例，平均年龄（59.57±9.28）岁。胃癌组样本在收集前患者均未进行手术、放疗和化疗等相关治疗。癌症诊断和肿瘤分期根据手术结果，按照美国癌症联合委员会癌症的TNM 分期系统第6版确定[2]。不适合手术治疗的患者，通过组织活检及影像学检查确定临床诊断和肿瘤分期。本研究经过本院伦理会批准，所有研究对象签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血清标本收集 用血清收集管分别收集5 ml胃癌组和对照组静脉血，室温静止1 h 后，4 ℃、3 500 r/min 离心10 min。将上层血清转移到新的收集管，4℃、16 000 r/min 离心10 min，除去细胞碎片，于-80℃保存。

1.2.2 血清总RNA 提取 采用Trizol LS 试剂（美国Invitrogen 公司）从血清中提取总RNA，按照试剂盒说明书进行操作。取250μl 血清，加入750μl Trizol LS，室温裂解后分别加入三氯甲烷、异丙醇及75%乙醇（北京化工厂）等试剂提取总RNA，用10μl RNase free ddH2O（美国Sigma公司）溶解RNA，于-80℃冻存备用。

1.2.3 qRT-PCR 将 血 清 总RNA 采 用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis 和SYBR qRT-PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司）逆转录生成cDNA。逆转录总反应体系为10μl，包含5.00μl mRQ 缓冲液、1.25μl mRQ 酶、3.75μl RNA 模板，逆转录反应条件：37℃、60 min，85℃、5 min。反应生成的cDNA 模板10 倍稀释后进行qRT-PCR。PCR 反应体系总体积20μl，miR-4286 正向引物由美国Invitrogen 公司合成，引物序列：5’-ACCCCACTCCTGGTACC-3’，通用引物和U6 引物均为试剂盒自带。使用QuantStudioTM7 Flex qRT-PCR 仪（美国ABI 公司）进行PCR 扩增，反应条件为：95℃预变性10 s，95℃变性5 s，60℃退火及延伸20 s，共40 个循环。每个样品设置3 个复孔，以U6 为内参照基因，基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1.2.4 肿瘤标志物的检测 采用全自动电化学发光免疫分析仪（瑞士罗氏公司）测定血清样本中肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9,CA19-9）和糖类抗原72-4（carbohydrate antigen 72-4,CA72-4）的表达量，检测结果通过查阅临床病例资料获得，上限值分别为5.0 ng/ml、39 u/ml 和8.2 u/ml。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，非正态分布的计量资料用非参数秩和检验（Mann-Whitney U）；计数资料以率或百分比表示，用Fisher 确切概率法；绘制受试者工作特征曲线（ROC），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌患者血清miR-4286 表达升高

qRT-PCR 结果显示，miR-4286 在对照组和胃癌组患者血清中的表达量分别为（1.810±2.099）和（4.707±4.649），经秩和检验，差异有统计学意义（Z=-4.644，P=0.000），胃癌组平均升高2.601 倍。 见图1。

图1 两组miR-4286 表达水平比较

2.2 miR-4286 的ROC 曲线诊断性能

绘制ROC 曲线，计算出约登指数，最大约登指数的对应值即为最佳预测值（Cut off 值）。经计算确定Cut off 值为3.381，此时曲线下面积（AUC）为0.727（95%CI：0.645，0.810），敏感性和特异性分别为48.8%和88.3%。以3.381为诊断阈值（即危险分数），将样本划分为两组，即高危险风险组和低危险风险组，前者代表胃癌患者，后者健康体检者，进行危险分数分析，结果显示血清miR-4286 诊断胃癌的阳性预测值和阴性预测值分别为0.872 和0.557。见表1和图2。

2.3 血清miR-4286 表达与胃癌临床病理特征的关系

将胃癌组根据性别、年龄、TNM 分期及病理分化程度等进行分类统计。Fisher 确切概率法结果表明，miR-4286 表达水平与肿瘤分化程度相关（P＜0.05），与性别、年龄、淋巴结转移、远处转移、临床分期无关（见表2）。秩和检验结果显示，胃癌血清中miR-4286 的表达量与淋巴结转移与否、远处转移与否及肿瘤临床分期（Ⅰ～Ⅳ）无关（Z=-1.270、-1.432 和-1.218，P=0.204、0.152和0.223），但其在低分化胃癌患者血清中的表达量高于中、高分化胃癌患者（Z=-2.661，P=0.008）（见 图3）。

表1 胃癌患者和健康对照者的危险分数分析

图2 miR-4286 的ROC 曲线

表2 胃癌临床因素与miR-4286 表达水平的关系 例

2.4 肿瘤标志物CA19-9、CEA 和CA72-4 在胃癌患者血清中的表达

通过查阅病例，对胃癌组和对照组样本的肿瘤标志物CA19-9、CEA 和CA72-4 检测结果进行统计分析。秩和检验结果显示，胃癌血清中CA72-4 表达量较对照组升高（Z=-3.324，P=0.001）；两组CA19-9和CEA 比较，差异无统计学意义（Z=-1.315 和-1.400，P=0.188 和0.161）（见图4）。ROC 曲线结果显示，CA19-9、CEA 和CA72-4 诊断胃癌的AUC 分别为0.574（95% CI：0.465，0.683）、0.579（95% CI：0.469，0.689）和0.691（95% CI：0.587，0.795）（见 图5）。

2.5 miR-4286 与CA72-4 对胃癌诊断的效能比较

以病理诊断为金标准，将miR-4286 与肿瘤标志物CA72-4 对胃癌的诊断效能进行比较，结果显示，miR-4286 诊断胃癌的特异性和阳性预测值高于临床常用肿瘤标志物CA72-4。见表3。

图3 miR-4286 表达水平与胃癌临床病理特征的关系 （±s）

图4 两组肿瘤标志物的表达水平比较

图5 CA19-9、CEA、CA72-4 的ROC 曲线

表3 血清miR-4286、CA72-4 诊断胃癌的敏感性和特异性比较

3 讨论

miRNA 是通过干扰1 个或多个靶mRNA 的翻译来调节转录后基因表达的微小非编码RNA，参与细胞生长、增殖、分化、凋亡和衰老等生理、病理过程[7]。 miRNA 通过影响癌基因和肿瘤抑制基因的表达成为人类致癌的重要调节因子，其异常调节可能与所有类型癌症的发病机制相关[8-9]，其表达水平在胃癌等多种恶性肿瘤中可作为潜在的诊断和预后生物标志物[10-12]。

miR-4286 是近年来发现的miRNAs，其在恶性黑色素瘤及食管癌组织中表达升高，miR-4286 通过靶向INPP4A基因激活JAK2/STAT3 信号通路，促进食管癌的发生，与食管癌患者的预后生存期高风险密切相关，有望成为食管癌治疗的靶点[13-14]。但miR-4286与其他肿瘤发生及诊断预后的关系未见报道。本研究通过qRT-PCR 实验发现，miR-4286 在胃癌血清中的表达量高于对照组，且其表达水平与肿瘤分化程度相关。笔者据此推测，miR-4286 可能参与胃癌细胞的恶性转化过程，但其发挥作用的分子机制还需进一步实验研究。

目前临床常用的胃肠道肿瘤标志物主要有CEA、CA19-9 和CA72-4，但其对胃癌诊断的敏感性和特异性都不高，如LIANG 等[15]对2 288 例胃癌患者和1 869 例对照组进行分析，发现CEA、CA19-9 和CA724 独立诊断胃癌的敏感性仅为20.1%～27.6%，而3 者联合诊断可将敏感性提高至48.2%。YU 等[16]对216 例胃癌患者的临床检测结果进行统计，结果CEA、CA19-9 和CA72-4 独立诊断的敏感性分别为22.69%、18.98%和22.69%，而3 者联合诊断的敏感性达44.91%。GUO 等[17]对1 566 例胃癌患者的临床检测结果进行ROC 曲线分析，结果CEA、CA19-9 和CA724 区分胃癌和健康人的AUC 分别为0.582、0.571和0.544。本研究发现，CA724 诊断的AUC 为0.691，高于文献报道[17]，但其独立诊断的敏感性和特异性分别为31.57%和55.95%，作为诊断标志物导致较高的漏诊率；而miR-4286 诊断胃癌的AUC 为0.727，诊断的特异性高达90%，阳性预测值为0.872，高于CA72-4，因此可能具有潜在的临床应用前景。

目前非编码RNA 的研究正如火如荼，由于循环miRNAs 反映癌症进展的状态，且其稳定性较好，因此可能是癌症快速检测和治疗的潜在生物标志物[18]。本研究初步探讨miR-4286 的表达水平与胃癌的关系，为阐明miR-4286 的生物学功能奠定了基础，至于miR-4286 的表达是否具有组织或器官特异性，以及其在肿瘤发生、发展中作用的分子机制，还需更深入的基础研究及大规模的临床样本进行验证。