卵泡抑素样蛋白4通过活化T细胞核因子抑制病理性心肌肥厚的发生发展

鲁悦新 石红杰 欧阳珊 孔祥杰 胡宇峰 姬燕晓 李红良

病理性心肌肥厚是心力衰竭和猝死发生的重要原因[1]，引起心肌肥厚的原因很多，临床上主要受遗传因素、高血压、内分泌、生活习惯等复杂因素共同影响。其中高血压是临床常见的心肌肥厚诱因之一，高血压性心脏病常伴随一系列并发症，包含左室肥厚、左房扩大、冠状动脉疾病、充血性心力衰竭等[2]。临床上很多治疗高血压的药物同样对心肌肥厚有很好的治疗作用[3]。研究表明，许多调控高血压的基因也参与调控心肌肥厚发生[4]。卵泡抑素样蛋白4(follistatin-like 4，FSTL4)是TGF-β超家族抑制剂follistatin基因家族的一员，广泛表达于心脏、肺、肾、睾丸、神经元、平滑肌和肠上皮中[5-6]。此前的一项研究，通过对高血压患者及其家族的基因图谱进行单核苷酸多态性分析，发现FSTL4的突变可能是影响高血压的一个关键诱因[6]。此外，研究发现FSTL4是肌肉发育的关键调节剂，与卒中风险增加相关[6-7]。因此，笔者利用FSTL4基因敲除小鼠和FSTL4过表达的心肌细胞来深入探究FSTL4在心肌肥厚中的作用与机制。

1 材料与方法

1.1 动物实验材料与方法

1.1.1实验动物 野生型(WT组)小鼠8只，FSTL4基因敲除(KO组)小鼠8只，体重24～26g、10周龄雄性小鼠。KO小鼠购买自RIKEN BioResource Research Center(RBRC04952)，饲养于武汉大学模式动物研究所SPF级实验动物屏障设施。

1.1.2病理性心肌肥厚模型的建立 WT和KO组小鼠均进行主动脉弓缩窄手术(TAC)[8-9]，构建压力超负荷诱导的左室心肌肥厚模型。腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉小鼠，沿第2～3肋间水平切开皮肤，依次分离肌肉及软组织，暴露出胸乳突肌，然后用直尖头镊提起左侧锁骨，用解剖剪紧贴胸骨剪断小鼠右侧锁骨，游离主动脉弓(无名动脉和左颈总动脉分叉处)，将7-0手术缝线穿过主动脉，将26G垫针及主动脉一起结扎，抽出针头造成主动脉70%缩窄，然后依次缝合切口。之后将小鼠以俯卧位放入恒温箱中至苏醒后，将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。

1.1.3超声检测 术后4周用异氟烷麻醉小鼠后，对左胸前区剃毛，小鼠取左侧卧位或仰卧位，在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂。采用高频超声诊断仪，频率设置为15 MHz，选取标准左室乳头肌短轴切面进行超声检测，测量并计算左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESd)、短轴缩短率(FS)及射血分数(EF)。

1.1.4组织病理学检测 超声检测结束后，称重后处死小鼠，迅速取出心脏和肺脏，分别称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重体重比(HW/BW)、肺重体重比(LW/BW)、心重与胫骨长度的比值(HW/TL)，评价心脏重量的增大程度。称重之后将心脏放入10%的福尔马林中固定24 h，再进行脱水、石蜡包埋、切片，天狼猩红染色(PSR)和苏木精-伊红染色(H&E)。

1.1.5实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR) 用TriPure Isolation Reagent(11667165001，Roche)提取心脏左心室的RNA，用逆转录试剂盒(4897030001，Roche)反转录成cDNA，加入荧光染料SYBR Green(04887352001，Roche)标记扩增产物进行qPCR实验，检测心肌肥厚基因心钠肽(Anp)、脑钠肽(Bnp)和心脏β-肌球蛋白重链(Myh7)，心肌纤维化基因I型胶原(Collagen Iα )、Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ)和结缔组织生长因子(Ctgf)的表达。所用引物由擎科生物科技有限公司进行化学合成，序列信息如下表：

表1 qPCR引物序列信息

1.1.6蛋白质印迹(Western blot)检测 用眼科剪迅速将心脏左室样本剪碎后放入EP管中，在干冰上操作，称重并记录样本重量。向每个EP 管中加入4颗钢珠和RIPA裂解液(100 μl/10 mg)，放入研磨仪中研磨组织，设置研磨参数：频率30 Hz，时间90 s。待研磨结束后取出钢珠，使用超声裂解仪裂解组织细胞，频率5K Hz，时间120 s。裂解完成后离心获得蛋白提取液，使用BCA 法(23225，Thermo Fisher Scientific)调平蛋白浓度，将蛋白样品变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳后将蛋白从凝胶转膜至PVDF膜，对PVDF膜使用5%的脱脂牛奶室温封闭1 h，4℃孵育一抗过夜，室温孵育二抗1 h，于Bio-Rad ChemiDocTMXRS+化学发光成像系统进行显影。实验中使用的一抗包括：FSTL4(ab214925，ABCAM)、GAPDH(2118，CST)、Flag(M185-3L，MBL)。

1.2 细胞实验材料与方法

1.2.1H9C2细胞免疫荧光染色 H9C2细胞购买自美国模式培养物集存库(ATCC)，利用慢病毒感染H9C2细胞构建FSTL4过表达的稳定细胞系。对细胞系饥饿12 h处理后，用1 μmol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)或对照液PBS刺激48 h，刺激后使用4%多聚甲醛固定细胞，将细胞置于0.1%Triton X-100中透化5 min，室温下用8%羊血清封闭1 h，加α-actinin(05-384，Merck Millipore，1∶100)室温孵育2 h进行染色，PBS漂洗后滴加荧光二抗(IgG[H + L]二抗，A21202，Invitrogen，1∶200)室温孵育1 h，PBS漂洗后加DAPI封片，于荧光显微镜下进行拍照。使用Image-Pro Plus 6.0软件测量细胞的表面积。

1.2.2双荧光素酶报告基因检测 对H9C2细胞同时表达对照Flag或FSTL4质粒、NFAT-luc、对照Actin-luc，18 h后用2μmol/L AngⅡ或对照液PBS刺激细胞12 h，刺激完成后裂解细胞。吸取20 μl细胞裂解液和100 μl荧光素酶测试试剂Ⅱ(LARII)混匀，立即检测萤火虫荧光素的荧光值，加入100 μl STOP& Glo Reagent试剂混匀，立即检测海肾荧光素的荧光值，荧光素酶的表达量与转录因子FSTL4对活化T细胞核因子(NFAT)的转录活性作用强度成正比。

1.3 统计学方法

数据结果通过平均数±标准差来表示，采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，两组之间均数比较使用独立样本t检验，多组间均数比较使用单因素方差分析，以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 两组小鼠实验结果

2.1.1两组超声指标及心肌肥厚程度的比较 Western blot结果显示KO小鼠心脏组织中FSTL4基因完全敲除(图1A)。TAC手术4周后，KO组小鼠的LVEDd和LVESd均显著高于WT组；而EF和FS显著低于WT组(表2)。TAC手术4周后KO组小鼠的HW/BW、LW/BW和HW/TL均显著高于WT组(表3)。

A：两组小鼠心脏组织中FSTL4表达水平；B：TAC手术4周后两组小鼠心肌肥厚和心肌细胞肥大程度

图1两组小鼠FSTL4蛋白表达和心肌肥厚程度的比较

表2 两组超声指标的比较

注：与WT组比较，*P<0.05

表3 两组HW/BW、LW/BW、HW/TL的比较

注：与WT组比较，*P<0.05

HE染色结果显示KO组小鼠心脏体积明显增大，心肌细胞面积显著增加(图1B，表4)。TAC手术4周后，qPCR结果显示KO组小鼠的Anp、Bnp和Myh7水平都高于WT组(表5)。

表4 两组心肌细胞面积的比较

注：与WT组比较，*P<0.05

表5 两组心肌肥厚基因表达量的比较

注：因n=3,未进行统计学处理，但KO组3个数据均高于WT组

2.1.2两组心肌纤维化程度的比较 PSR染色结果显示，KO组小鼠心脏组织血管周纤维化和间质纤维化程度加重(图2)，统计学分析表明KO组小鼠心肌的胶原纤维含量显著升高(表6)。qPCR结果显示，KO组小鼠的心脏纤维化指标Collagen Iα、CollagenⅢ和Ctgf都升高，显示出严重的纤维化(表7)。

TAC手术4周后两组小鼠心肌纤维化程度

组别n胶原百分比(%)WT组52.03±0.78KO组55.19 ±2.50∗

注：与WT组比较，*P<0.05

表7 两组心肌纤维化基因表达量的比较

注：因n=3,未进行统计学处理，但KO组3个数据均高于WT组

2.2 H9C2细胞实验结果

2.2.1FSTL4对心肌细胞肥大的影响 Western blot结果显示FSTL4稳定细胞系中FSTL4的蛋白表达水平增加情况(图3A)。免疫荧光染色结果显示AngⅡ刺激导致心肌细胞肥大，FSTL4过表达能够抑制AngⅡ刺激导致的心肌细胞肥大(图3B、表8)。qPCR结果显示过表达FSTL4能够显著降低心肌肥厚指标Anp和Myh7的表达(表9)。

2.2.2FSTL4对NFAT转录活性的影响 双荧光素酶报告基因检测结果显示，AngⅡ刺激H9C2细胞后活化T细胞核因子(NFAT)的转录活性显著上升，过表达FSTL4能够显著抑制AngⅡ刺激诱导的NFAT转录激活(表10)。

3 讨论

本研究采用FSTL4-KO小鼠为研究对象，在主动脉弓缩窄手术4周后检测心脏重量、通过病理分析

A：H9C2细胞中FSTL4的过表达效率；B：AngII刺激后对照和过表达FSTL4的H9C2心肌细胞肥大程度

图3 FSTL4过表达对心肌细胞肥大的影响

注：与Flag PBS组比较，*P<0.05；与Flag AngII组比较，#P<0.05

表9 不同组别心肌肥厚基因表达量的比较

注：因n=3,未进行统计学处理，但Flag AngⅡ组3个数据均高于Flag PBS组，Flag-FSTL4 AngⅡ组数据均低于Flag AngⅡ组

表10 不同组别NFAT转录活性的比较

注：因n=4,未进行统计学处理，但Flag AngⅡ组3个数据均高于Flag PBS组，Flag-FSTL4 AngⅡ组数据均低于Flag AngⅡ组

和超声检测，结合实时荧光定量PCR检测心肌肥厚和心脏纤维化标志基因变化，全面考察了FSTL4对压力超负荷诱导的病理性心肌肥厚的功能和作用。结果显示FSTL4敲除之后，心肌细胞增大，心肌肥厚程度加重，心功能恶化，心肌纤维化程度加重，表明FSTL4敲除进一步促进了病理性心肌肥厚和心脏重构的发生发展。此外，采用FSTL4过表达的H9C2细胞为研究对象，并使用AngⅡ刺激诱导心肌细胞肥大模型。结果显示过表达FSTL4显著降低AngⅡ诱导的心肌细胞体积增大和心肌肥厚相关指标的表达，提示过表达FSTL4可抑制心肌肥厚的发生。

据报道，心肌肥厚的发生受多种复杂细胞信号通路调控，包含丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B、蛋白激酶 C和钙调神经磷酸酶(Calcineurin)/激活NFAT等信号通路[10-12]。这些复杂的信号网络，通过感知上游刺激，调控基因转录、线粒体功能、内质网应激、活性氧释放、炎症反应等一系列分子事件，调控心肌细胞中大量蛋白质合成和表型转化[13]。FSTL4 预测为一个分泌蛋白，结构分析表明其由一个类卵泡抑素结构域、一个钙离子结合结构域和两个类免疫球蛋白结构域组成。FSTL4可影响小鼠视网膜发育[14]，此外，FSTL4通过调控脑源性神经营养因子的成熟和外泌来调控小鼠轴突分支[15]。

本研究显示FSTL4抑制NFAT转录活性，提示FSTL4很可能作为一个钙离子结合蛋白，通过调控Ca2+-Calcineurin-NFAT信号通路，影响下游NFAT信号通路的激活。Ca2+增加可以激活钙调神经磷酸酶Calcineurin，与转录因子NFAT结合，通过去除NFAT N端保守的丝氨酸残基对其进行去磷酸化，导致NFAT向细胞核易位，激活心肌肥厚前体基因的表达。据报道，转录因子NFAT在激活后，可直接调控心肌肥厚标志物BNP的表达[16]。本研究中小鼠敲除FSTL4后，BNP表达显著性上升，提示FSTL4可能通过Calcineurin-NFAT信号调控心肌肥厚和心脏重构发生。