芪山无糖颗粒对糖尿病前期大鼠SOCS-3及JAK2 STAT1的影响

侯鹏超 叶迅 魏燕 洪郁芝*

近年来糖尿病在我国的形式日益严峻，如何早发现早诊断早治疗成为糖尿病现在研究的热点。目前认为糖尿病前期的糖代谢异常具有高度的可逆性，即给予该阶段及时、合理、科学的干预措施，糖尿病前期可以逆转为糖耐量正常。国外已有罗格列酮干预糖尿病前期的实验研究，但其存在心血管副作用、患者依从性差等状况，较难适应目前我国国情。芪山无糖颗粒是本院对糖尿病前期经典方进行有效成分提取、生产工艺优选后制成的复方饮片颗粒剂。2013年3月至2014年9月作者通过大鼠动物实验，进一步探讨芪山无糖颗粒剂干预糖尿病前期的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 4周龄雄性SPF级SD大鼠60只，体重（100±20）g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供［SCXK(沪)2013-0016］。饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心［SCXK(浙)2008-0115］。温度（20±2）℃，相对湿度50%～70%，12h/12h交替照明。芪山无糖颗粒配置自杭州市中医院制剂中心，由黄芪、山药、茯苓、黄连、绞股蓝、炒枳壳、生山楂、川芎、葛根、苍术配置而成，经浓煎后提取上清液制作成颗粒剂，批号：130405；马来酸罗格列酮购自英国GlaxoSmithKline公司；SOCS-3引物购买自生工生物工程(上海)股份有限公司；JAK2抗体购自美国Proteintech公司，STAT1抗体购自英国Abcam公司。

1.2 方法 （1）分组和建模：SD雄性大鼠通过长期的高糖高脂喂食制造糖尿病前期模型。取出生4周SD雄性大鼠60只，体重（100±20）g，普通饲料喂食2周适应环境后，随机分成6组：正常对照组（NC）、高脂对照组（MC）、 低剂量中药组（Z1）、中剂量中药组（Z2）、高剂量中药组（Z3）、罗格列酮组（X）。每组10只，其中8只为实验用鼠，其余2只为备用。NC组采用大鼠普通饲料喂食，MC、Z1、Z2、Z3、X组采用大鼠高脂饲料喂食；16周后 MC、Z1、Z2、Z3、X比NC的体重和2hPG同时出现显著增高（P＜0.01），糖尿病前期造模成功。（2）药物干预：造模成功后，各组继续原饲料喂养同时，并予以药物灌胃治疗16周。NC、MC组采用蒸馏水2ml/d灌胃，Z1、Z2、Z3组分别使用中药 1.5625g/（kg·d）（等同于人的用量）、3.125g/（kg·d）（等同于人用量的 2 倍）、6.25g/（kg·d）（等同于人用量的4倍)灌胃，X组采用罗格列酮0.833mg/（kg·d）（相当于人的最大推荐剂量）灌胃。用药16周后，用戊巴比妥钠麻醉大鼠后处死。（3）RT-PCR检测大鼠肝脏SOCS-3基因表达。取大鼠肝脏组织用TRIzol提取RNA，并检测RNA浓度。将相同浓度的RNA逆转为cDNA，按照预设引物(见表1)实行PCR扩增。β-action：94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 30s；共27个循环。SOCS-3：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s；共34个循环。最后进行琼脂糖电泳和分析。整个过程重复3次，最终确定SOCS-3的基因表达量。（4）Western Blot检测大鼠胰腺JAK2、STAT1蛋白表达：取大鼠胰腺组织用RIPA裂解液提取蛋白，并检测蛋白浓度。将相同浓度的蛋白进行蛋白电泳，并完成转膜。相应加入JAK2、STAT1一抗和荧光二抗进行孵育。最后在双色荧光成像系统上进行分析。整个过程重复3次，最终确定JAK2和STAT1的蛋白表达量。

表 1 PCR引物

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较使用方差分析，组间两两比较，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Tamhane’s T2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组体重和2hPG比较 见表2。

表 2 各组体重和2hPG比较（±s）

表 2 各组体重和2hPG比较（±s）

注：与NC组比较，*P＜0.01

组别 n 基础体重（g） 16周体重（g） 基础2hPG（mmol/L）16周2hPG（mmol/L）NC 8 218.35±8.95 454.09±39.94 6.81±0.50 6.74±0.23 MC 8 217.46±19.54 543.96±69.05* 6.18±0.60 8.80±0.86*Z1 8 217.56±13.17 537.41±64.53* 6.68±0.80 9.21±0.85*Z2 8 224.11±9.91 539.00±40.06* 6.65±0.60 8.71±0.74*Z3 8 215.08±12.38 527.54±48.09* 6.58±0.89 8.68±0.78*X 8 218.81±13.47 529.99±53.12* 6.91±1.03 9.01±0.65*

2.2 各组SOCS-3基因表达比较 见表3。

表 3 各组SOCS-3基因表达（±s）

表 3 各组SOCS-3基因表达（±s）

注：与NC组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与MC组比较，▲P＜0.05；与Z两组比较★P＜0.05

SOCS-3 NC 8 0.4698±0.1694 MC 8 1.6731±0.1796△△Z1 8 1.4945±0.3093△△Z2 8 1.0324±0.1933△△▲Z3 8 0.7363±0.099△▲★X 8 0.7275±0.1052△▲★n

2.3 各组JAK2、STAT1表达比较 见表4。

表4 各组JAK2、STAT1表达比较（±s）

表4 各组JAK2、STAT1表达比较（±s）

注：与NC组比较，△P＜0.05；与MC组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与Z1组比较■P＜0.05，■■P＜0.01；与Z两组比较★P＜0.05，★★P＜0.01；与Z3比较，#P＜0.05

8 1.334±0.2075▲▲■■★# 1.2755±0.0714△▲▲■■★★JAK2 STAT1 NC 8 1.408±0.2983 1.6946±0.1325 MC 8 0.4874±0.1639△ 0.4073±0.2172△Z1 8 0.7469±0.2043△▲ 0.857±0.1842△▲▲Z2 8 0.953±0.1364△▲▲■ 1.0368±0.1836△▲▲■Z3 8 1.0788±0.0897△▲▲■■ 0.7217±0.1826△▲▲★★X n

3 讨论

2型糖尿病大鼠动物模型建立已有较为成熟建模方法，一般采用小剂量左旋链脲菌素(STZ)20～30mg/kg腹腔注射破坏大鼠胰腺达到大鼠血糖升高，同时配合高脂饮食造成大鼠肥胖，两者结合达到造模要求［1］。但目前缺乏糖尿病前期模型建立的相关文献，而采用STZ建立糖尿病前期模型较难得到满意的效果，STZ的胰腺破坏效果不稳定，且与注射前大鼠空腹时间有密切的关系，空腹时间越长胰腺破坏程度越严重，常造成20～30mmol/L高血糖，无法符合糖尿病前期的造模要求；Ionut V认为采用STZ建立的动物模型，是通过急性破坏胰腺，使胰腺功能急剧下降的情况下建立的，此时动物无肥胖和胰岛素抵抗，这使建立的模型更像是1型糖尿病而非其他［2］。因此确立糖尿病前期新的造模标准是实验成功的保证。Soares E对成年Wistar大鼠采用高糖饮食，9周后与普通饮食大鼠比较，高糖Wistar大鼠表现出体重及血糖升高并伴有高胰岛素血症，以此认为糖尿病前期模型建立成功［3］。本实验采用同样的思路，使用较Wistar大鼠血糖表现更为稳定的SD大鼠，并通过更长时间(16周)的高糖高脂喂食，促使其体重和餐后2h血糖的同时升高（P＜0.01），以此确立糖尿病前期造模成功的标准。

本资料结果显示，SOCS-3的基因表达随着中药浓度的增加出现显著下降（P＜0.01），其中以Z3组下降最为明显，且与罗格列酮组的效果相当（P＞0.05）。表明芪山无糖颗粒随着药物浓度的增加能显著降低SOCS-3的基因表达，且与罗格列酮效果相似。JAK2蛋白的表达则随着中药浓度的增加出现不同程度的回升（P＜0.05或 0.01），其中 Z2、Z3组表现相当（P＞0.05），但劣势与罗格列酮组差异有统计学意义（P＜0.05）。而在STAT1蛋白表达上，中药中Z两组的表达最为明显（P＜0.05），但仍劣于罗格列酮组的表现（P＜0.01）。表明芪山无糖颗粒能升高JAK2和STAT1蛋白的表达，但受到药物浓度的影响并不明显，且与罗格列酮存在差距。

JAK/STAT信号通路在糖尿病前期中有重要作用。目前认为JAK/STAT信号通路是参与瘦素传导的主要通路，瘦素能促使JAK2络氨酸激酶的活化，从而促使STAT3、STAT5的激活，并最终导致增加胰岛素的敏感性、降低血糖、抑制食欲、减轻体重［4］。有研究显示在基因敲除的STAT3、STAT5小鼠中出现了明显的摄食过量、肥胖、不孕等［5］。而糖尿病前期时，瘦素出现抵抗使其丧失对血糖的调节作用，进而加速了1型和2型糖尿病的发生［6］。因此在药物对糖尿病前期的干预过程中，JAK2、STAT3、STAT5指标的表达恢复可以认为治疗有效的标志。本资料中，芪山无糖颗粒干预后JAK2蛋白出现了明显回升（P＜0.05或0.01），虽然和罗格列酮的治疗效果尚存在一定的差距（P＜0.05），但已经可以证明芪山无糖颗粒可以逆转JAK2蛋白的表达，有效干预糖尿病前期的进展。同时STAT1指标也出现了恢复（P＜0.01），同样证明芪山无糖颗粒对STAT家族的恢复作用。

SOCS家族是JAK/STAT信号通路的上游抑制因子，其一些成员参与胰岛素受体信号转导［7］。目前认为胰岛素、瘦素、生长激素等可诱导SOCS-3的基因表达，而其表达产物又可阻止这些细胞因子信号的传导［8］。Peralta S研究证明，在胰岛素抵抗及瘦素抵抗的Sprauge-Dawley大鼠下丘脑中，SOCS-3的基因表达水平增加，而实施饮食控制后，SOCS-3基因表达得到控制，提示SOCS-3参与胰岛素抵抗及瘦素抵抗［9］。因此在糖尿病前期中，SOCS-3可能出现表达增加，从而抑制JAK/STAT信号通路限制JAK2、STAT的表达。因此使用药物对糖尿病前期进行干预，SOCS-3表达减少认为治疗有效。本资料中，芪山无糖颗粒干预后SOCS-3基因表达迅速出现回落（P＜0.05或＜0.01），其在大剂量药物干预的过程中表现出和罗格列酮相同的效果，表明芪山无糖颗粒可以降低SOCS-3基因表达，改善糖尿病前期。

综上所述，芪山无糖颗粒能逆转糖尿病前期大鼠SOCS-3基因及JAK2、STAT1蛋白表达，证实其在早期延缓糖尿病的发生发展有着重要作用，为进一步探讨芪山无糖颗粒剂干预糖尿病前期的作用机制提供理论依据，为探索适合我国国情糖尿病前期的干预方法提供中药学依据。但其对SOCS以及STAT其他家族成员是否具有同样作用尚需要进一步研究证实。