磁性纳米Fe3O4对黄鲫蛋白抗菌肽的富集作用

冀雪莉 韦荣编 宋茹

摘要 [目的]以磁性Fe3O4粒子为基粒，采用溶胶-凝胶法在基粒表面键合二氧化硅，将基粒制成改性磁性纳米Fe3O4用于吸附黄鲫蛋白抗菌肽中的活性肽，从而达到对黄鲫蛋白肽中有效抗菌组分的快速分离富集。[方法]黄鲫蛋白肽经改性磁性纳米Fe3O4吸附后，测定抑菌率、肽含量、蛋白质含量和氨基酸含量指标，再结合透射电镜分析和高效液相分析结果，比较黄鲫蛋白肽在吸附前后的变化。[结果]透射电镜结果显示，改性磁性纳米Fe3O4吸附黄鲫蛋白抗菌肽，可在粒子表面形成“冕层”。经改性磁性纳米Fe3O4吸附后，黄鲫蛋白抗菌肽液对大肠杆菌的抑菌作用显著降低，其中黄鲫蛋白肽中的肽含量、蛋白质含量分别由吸附前的7.249 mg和416.221 μg降低至6.297 mg和346.183 μg，而吸附后肽液中氨基酸含量则略有提高。高效液相分析结果表明，黄鲫蛋白肽经改性磁性纳米Fe3O4吸附后主要分离峰的保留时间和峰面积均发生改变。[结论]改性磁性纳米Fe3O4能有效吸附黄鲫蛋白肽中的抗菌肽，实现对抗菌组分的分离富集作用。

关键词 黄鲫蛋白肽;抗菌;磁性Fe3O4粒子;表面修饰;富集

中图分类号 TS254.4文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）10-0141-03

Abstract [Objective]The magnetic Fe3O4 particles was modified by combining the silica layer using the solgel method，with the aim of enrichment of antibacterial peptide from halffin anchovy hydrolysates （HAHp）.[Method]Determine the inhibition rate，peptide content，protein content and amino acid content of absorbed HAHp，and combine the results of transmission electron microscopy and high performance liquid phase analysis to compare the changes of HAHp before and after adsorption.[Result]Transmission electron microscopy showed that a coronal layer was formed on the surface of modified magnetic Fe3O4 after treated with HAHp.The antibacterial activity of HAHp was significantly reduced after adsorption by modified magnetic particles.The amounts of peptide and protein in HAHp were decreased from 7.249 mg to 6.297 mg，and 416.221 μg to 346.183 μg，respectively.By comparison，the amino acid content of HAHp was slightly increased after modified magnetic particles adsorption.Furthermore，the result of highperformance liquid phase analysis showed the changes of retention time and peak area for major peaks in HAHp after adsorbed by modified magnetic particles.[Conclusion]Our results suggested that the modified magnetic Fe3O4 particles could effectively enrich the antibacterial peptide from HAHp.

Key words Halffin anchovy peptides;Antibacterial activity;Magnetic Fe3O4 particles;Surface modification;Enrichment

黄鲫（Setipinna taty）属于辐鳍鱼纲、鲱形目、鳀科、黄鲫属，在我国东海、南海、渤海等海域可以常年捕获，且捕获量较大[1]。通过酶解法制备的黄鲫蛋白肽除了抗菌活性外，还具有抗氧化、抑制肿瘤细胞增殖等生物活性[2-5]。前期研究中发现黄鲫蛋白肽的抑菌活性与其所带电荷性有关[2]。磁性纳米材料通常是由超顺纳米磁性粒子与无机或有机分子通过包覆或交联等方式形成，可均匀分散于溶液中保持较高稳定性。将磁性纳米材料作为吸附剂，不仅具有较高的比表面积、良好的生物相容性，而且基于磁性材料的分離富集操作简单，能够快速达到吸附平衡，所以在生物工程中的应用越来越广泛[6-7]。该研究以磁性Fe3O4为基粒，经表面修饰改性使基粒表面带有更多的荷电基团，如羟基、氨基[8]，将改性后的磁性Fe3O4用于吸附黄鲫蛋白肽中有效抗菌肽，以达到快速分离、富集抗菌肽的目的。

1 材料与方法

1.1 主要材料

黄鲫蛋白肽（浙江海洋大学食品与医药学院实验室制备）;Fe3O4购于上海阿拉丁集团;柠檬酸三钠购于宜兴市第二化学试剂厂;正硅酸乙酯、乙醇、氨水、氢氧化钠、氯化钠、浓盐酸、邻苯二甲醛（OPA）、甲醇、十二烷基硫酸钠（SDS）、四硼酸钠、β-巯基乙醇、G-250考马斯亮蓝，均购于国药集团化学试剂有限公司;营养琼脂，购于青岛海博生物技术有限公司;总氨基酸试剂盒和总巯基试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 磁性Fe3O4纳米粒子修饰改性。

参照文献[9]的方法并适当修改，以Fe3O4为基粒，制备改性磁性Fe3O4粒子。

1.2.2 改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附黄鲫蛋白抗菌肽。

将磁性Fe3O4纳米粒子与黄鲫蛋白肽按照1∶100比例（mg/mL）混合，微量振荡器振荡1 h，磁铁分离磁性Fe3O4纳米粒子，收集吸附后黄鲫蛋白肽，备用。

1.2.3 改性磁性Fe3O4纳米粒子的微观结构表征。透射电镜法观察改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附黄鲫蛋白肽后的微观结构，未吸附黄鲫蛋白肽的改性磁性粒子为对照。

1.2.4 抑菌性测定。

参照96孔板法[4]测定，以大肠杆菌为指示菌，测定黄鲫蛋白肽经改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附前后抑菌率。

1.2.5 肽、蛋白质和氨基酸含量测定。

测定黄鲫蛋白肽经改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附前后的肽含量、蛋白质含量和氨基酸含量变化。肽含量的测定采用OPA方法[10]，蛋白质含量测定采用Bradford法[11]，氨基酸含量测定采用总氨基酸测定试剂盒法。

1.2.6 吸附前后黄鲫蛋白肽的色谱分离。

采用高效液相色谱法（HPLC）比较黄鲫蛋白肽经改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附前后主要分离峰变化，具体条件如下：样品经0.22 μm 滤膜过滤，进样量 10 μL，采用PL aquagel-OH柱（75 mm×300 mm，8 μm）分离，30%乙腈为洗脱剂，流速0.5 mL/min，柱温25 ℃，检测波长280 nm，根据保留时间和峰面积判定吸附前后黄鲫蛋白肽中主要分离峰变化情况。

1.3 数据统计分析

数据采用平均值 ± 标准差（n=3）形式表示，用SPSS 19.0 软件对组间差异性进行显著分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附黄鲫蛋白肽前后微观结构比较

从图1可以看出，改性磁性Fe3O4纳米粒子在吸附黄鲫蛋白肽之前具有较为规则的球形结构，尺寸分布较窄，粒径均匀，直径在100～200 nm。吸附黄鲫蛋白肽后改性磁性Fe3O4纳米粒子直径在50～250 nm，表面被浅层膜包裹，形成了“核壳结构”磁性粒子。磁性纳米Fe3O4经改性后可在粒子表面键合大量的-OH、-COOH等带负电荷基团[12]。推测改性磁性Fe3O4纳米粒子表面形成类似“水膜”层与黄鲫蛋白肽中的正电荷肽吸附到粒子表面有关。

2.2 黄鲫蛋白肽经改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附后抑菌率变化

抑菌率和肽含量变化是评价改性磁性Fe3O4纳米粒子对黄鲫蛋白肽中抗菌肽是否发生吸附的重要指标，如果经纳米粒子吸附后黄鲫蛋白肽的抑菌率和肽含量降低，说明黄鲫蛋白肽的有效抗菌肽组分被改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附。

从表1可看出，黄鲫蛋白肽对大肠杆菌的抑菌率由吸附前的42.52%降至吸附后的28.22%（P<0.05），经测定黄鲫蛋白肽的肽含量和蛋白质含量分别由吸附前的7.249 mg和416.221 μg降低至6.297 mg和346.183 μg（P<0.05），而吸附后黄鲫蛋白肽溶液中氨基酸含量则由吸附前的14.656 mg提高至16.581 mg（P<0.05）。表明改性磁性Fe3O4纳米粒子能有效吸附黄鲫蛋白肽中抗菌肽组分，综合图1微观结构分析，说明被改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附到粒子表面形成的“水膜”应与抗菌作用有关的抗菌肽吸附有关。

2.3 黄鲫蛋白肽经改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附后色谱分离

图2a分离结果显示黄鲫蛋白肽主要有7个分离峰，经改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附后，图2b中对应的峰2（P2）吸光强度降低明显，说明峰2在吸附后的黄鲫蛋白肽中含量降低。另外，图2a中峰5（P5）的保留时间在图2b中延长。王岭[12]报道磁性Fe3O4粒子经表面改性后可以选择性吸附疏水性多肽或荷电多肽。综合以上结果，可以判定该研究所用的改性磁性Fe3O4纳米粒子能有效吸附黄鲫蛋白肽中抗菌肽组分。

3 结论

该研究通过溶胶-凝胶法制备了改性磁性Fe3O4纳米粒子，通过吸附试验发现，被吸附后的黄鲫蛋白肽的抑菌率降低、肽含量和蛋白质含量降低、总氨基酸含量增加，说明改性磁性Fe3O4纳米粒子能有效吸附黄鲫蛋白肽中抗菌肽，并能在磁性粒子表面形成蛋白或肽层。HPLC分离试验表明，黄鲫蛋白肽中的一些分离峰经改性磁性Fe3O4纳米粒子吸附后，强度或保留时间变化明显，原因可能是与吸附后的黄鲫蛋白肽的抗菌活性变化有关，后续还需进一步探究被吸附的肽组分特征。

参考文献

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