3株传染性支气管炎病毒蛋鸡源河南株的S1基因序列分析

吴倩倩，许 鑫，陈钦玺，阚云超，姚伦广，王新卫，冀 君

(1.南阳师范学院 南阳市兽医生物工程技术研究中心/河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，河南 南阳 473061； 2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病[1]。IB在肉鸡临床上多以呼吸道症状和肾肿为特征，会引起高达30%的死淘率；蛋雏鸡感染IB后，除可引起死亡外,还会造成母鸡生殖系统的永久不可逆性损伤，表现为输卵管和卵巢发育不良或输卵管、子宫大量积水囊肿，最终造成“假母鸡”，出现无产蛋高峰、产蛋数量及蛋品质下降现象。此外，IB还有“腺胃型”、“肌肉损伤型”和其他复杂的临床症状，除了能够引起由鸡的生产性能下降所导致饲料报酬降低外，当其与大肠杆菌、支原体以及其他病毒性疾病等混合感染时还会加大临床观诊难度，从而造成巨大的经济损失并威胁养鸡业的健康发展[2]。

IBV属于冠状病毒科冠状病毒亚科的Gamma冠状病毒，病毒基因组为不分节的单股正链RNA，全长约27.6 kb，编码小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和纤突蛋白(S)等4种主要结构蛋白[3-4]。纤突蛋白(S)与宿主细胞膜上的病毒受体结合后被宿主细胞的蛋白酶裂解为N端的S1蛋白和C端的S2蛋白[5]。其中，S1蛋白与IBV的感染性、致病性及组织嗜性密切相关，能诱导机体产生中和抗体、血凝抑制抗体及细胞介导的免疫应答[6-8]，它也是决定IBV血清型特异性抗原决定簇的主要蛋白质[9-10]。由于IBV复制依赖RNA聚合酶，而RNA聚合酶缺乏校正能力[11]，因此，病毒在复制过程中极易发生变异或重组。且随着疫苗的使用，会进一步加快IBV的基因变异。由于IBV不同毒株间S1基因变异较大，而S1基因序列会随着IBV毒株的进化发生差异累积，导致IBV毒株间的交叉保护程度减弱甚至完全丧失[12-13]。S1基因核苷酸序列的插入、缺失、点突变或重组可直接导致众多血清型或基因型的出现[14]。因此，基于S1基因的序列差异分析是IBV分子流行病学调查内容中的重点[15-17]。

本研究于2017年春季和秋季从河南省不同发病鸡场采集的疑似IB发病蛋鸡病料中分离到3株IBV，对其S1基因进行克隆、测序和序列分析，以期了解河南省IBV的流行情况，为有效防控IB提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试病料与鸡胚来源 供试病料为采集自南阳、信阳和安阳市鸡场疑似IBV感染的病死蛋鸡的气管、肺脏和肾脏等；9日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.1.2 主要耗材与试剂 pMD18-T载体、大肠杆菌Top10感受态细胞、DNA分子质量Marker购自大连TaKaRa公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、TransScript One-Step RT-PCR SuperMix购自北京全式金生物公司；DNA纯化、回收试剂盒购自美国OMEGA公司。

1.2 IBV的分离与鉴定

将疑似感染IBV的病死蛋鸡的气管、肾脏等组织浸泡液氮并研磨成细粉，再加入5倍体积的冷冻PBS缓冲液(含200 U/mL青霉素和200 μg/mL链霉素)后混匀，反复冻融3次，5 000×g离心10 min，收集上清液后通过0.2 μm滤膜进行过滤。取0.2 mL滤液接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔，于37 ℃孵育48 h后收取鸡胚的尿囊液，如此重复盲传3代。抽提盲传3代后的鸡胚尿囊液病毒总RNA，采用M基因和3′UTR的检测引物，进行RT-PCR检测。检测引物参考尚辉琴等[18]的研究，即用于扩增M基因的上游引物序列为5′-CCTAAGAACGGTTGGAAT-3′，下游引物序列为5′-TACTCTCTACACACACAC-3′，扩增目的条带长度为290 bp；用于扩增3′UTR保守基因片段的上游引物序列为5′-GGAAGATAGGCATGTAGCTT-3′，下游引物序列为5′-CTAACTCTATACTAGCCTAT-3′，扩增目的条带长度为740 bp。

1.3 IBV分离株S1基因的克隆与测序

根据GenBank中公布的IBV的基因序列，利用Primer Premier 5.0设计S1基因引物(上游引物为5′-AAGACTGAACAAAAGACCGACT-3′，下游引物为5′-CAAAACCTGCCATAACTAACATA-3′)。参照TransScript One-Step RT-PCR SuperMix试剂盒中的说明书，以提取的鸡胚尿囊液病毒总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，扩增体系为20 μL：总RNA 0.5 μL，R-Mix 10 μL，E-Mix 0.3 μL，上、下游引物各0.6 μL，ddH2O补加至20 μL。RT-PCR程序：45 ℃ 30 min，95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环30次；72 ℃延伸10 min。电泳后回收RT-PCR产物，将其连接至pMD18-T载体并转化入大肠杆菌Top10感受态细胞中。最后将筛选出的阳性菌液，送至苏州泓迅生物科技有限公司测序，并对测序鉴定正确的IBV分离株进行命名。

1.4 IBV分离株S1基因序列的同源性分析

将获得的测序鉴定正确的IBV分离株S1基因序列用DNASTAR 7.1软件包中的“Seqman”进行拼接，并以NCBI下载的50株IBV的S1基因序列为参考进行同源性比较分析(表1)。使用MEGA 5.05软件中的“Clustal W”先进行多序列比对，再采用Neighbor-Joining方法，对IBV分离株和参考株的S1基因构建系统发育进化树，参考LI等[19]研究中对IBVS1基因的分型方法。根据系统发育进化树，得知核苷核序列和氨基酸序列的同源性。使用SimPlot 3.5.1和RDP 4.36软件进行IBVS1基因遗传重组分析。

表1 50株IBV参考毒株Tab.1 50 IBV reference strains

续表1 50株IBV参考毒株Tab.1(Continued) 50 IBV reference strains

注：ND表示没有记录。裂解位点分别为HRRRR1：His-Arg-Arg-Arg-Arg；RRFRR2：Arg-Arg-Phe-Arg-Arg；RRSRR3：Arg-Arg-Ser-Arg-Arg；HRRKR4：His-Arg-Arg-Phe-Arg；HRHKR5：His-Arg-His-Lys-Arg；RRLRR6：Arg-Arg-Leu-Arg-Arg；RRSKR7：Arg-Arg-Ser-Phe-Arg；RRHRR8：Arg-Arg-His-Arg-Arg；HRFRR9：His-Arg-Phe-Arg-Arg。

Note：ND means no documentation.Cleavage recognition motifs were HRRRR1:His-Arg-Arg-Arg-Arg;RRFRR2:Arg-Arg-Phe-Arg-Arg;RRSRR3:Arg-Arg-Ser-Arg-Arg;HRRKR4:His-Arg-Arg-Phe-Arg;HRHKR5:His-Arg-His-Lys-Arg;RRLRR6:Arg-Arg-Leu-Arg-Arg;RRSKR7:Arg-Arg-Ser-Phe-Arg;RRHRR8:Arg-Arg-His-Arg-Arg;HRFRR9:His-Arg-Phe-Arg-Arg.

2 结果与分析

2.1 IBV病毒的分离与鉴定

如图1所示，以鸡胚尿囊液中提取的病毒总RNA作为模板，利用M基因和3′UTR的检测引物通过RT-PCR方法进行检测，结果表明，分别扩增出290 bp与740 bp的条带，与预期目的条带大小一致，表明疑似感染IBV的病死鸡确实有IBV感染。

M：DL2000 DNA Marker；1、2：M和3′UTR基因的RT-PCR产物；3、4：阴性对照

2.2 IBV分离株S1基因的克隆与测序

如图2所示，以鸡胚尿囊液中提取的病毒总RNA作为模板，对IBV分离株的S1基因进行RT-PCR扩增，结果表明，扩增出的条带与预期目的条带大小一致，约为1 700 bp。测序结果正确的3个IBV分离株分别被命名为CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/AY119/2018，其S1基因全长均为1 617 nt，编码539 aa。

M:DL2000 DNA Marker；1:S1基因的RT-PCR产物；2:阴性对照

2.3 IBV分离株S1基因的遗传进化、同源性和裂解位点分析

如图3所示，根据IBVS1基因绘制的遗传进化树显示，3个IBV分离毒株与所有参考毒株主要分成CHⅠ(QX)、4/91(CHⅡ)、CHⅢ、CHⅣ、CHⅤ、CHⅥ、Mass等7个不同的进化分支(基因型)，IBV分离株CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/AY119/2018均属于4/91(CHⅡ)基因型。如图4和图5所示，核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析表明，3个IBV分离毒株间的核苷酸和氨基酸的同源性较高，核苷酸和氨基酸同源性分别为94.4%～98.7%和93.5%～97.8%；CK/CH/HN/NY1206/2017与CK/CH/HN/XY911/2017核苷酸和氨基酸同源性高达98.7%和97.8%；CK/CH/HN/NY1206/2017与CK/CH/HN/AY119/2018核苷酸和氨基酸同源性分别为94.9%和94.2%；CK/CH/HN/XY911/2017与CK/CH/HN/AY119/2018核苷酸和氨基酸同源性分别为94.4%和93.5%。3个分离株的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列，与位于同一基因型的参考毒株间同源性较高，与我国使用的Mass型常规疫苗H120和H52毒株的核苷酸和氨基酸同源性最低，分别仅为78.3%～78.4%和74.8%～75.4%，与4/91(CHⅡ)型疫苗4/91毒株的核苷酸和氨基酸同源性较高，分别达到94.7%～99.3%和93.9%～98.1%。推导的氨基酸序列显示，CK/CH/HN/NY1206/2017与CK/CH/HN/XY911/2017基因裂解位点为RRSRR，CK/CH/HN/AY119/2018为RRFRR，与基因型4/91(CHⅡ)分支中参考毒株裂解位点一致。

图3 IBV分离株与参考毒株S1基因进化树Fig.3 Phylogenetic trees constructed based on S1 gene from IBV isolates and reference strains

图4 IBV分离株与参考毒株核苷酸序列同源性

图5 IBV分离株与参考毒株氨基酸序列同源性

2.4 IBV分离株S1基因的遗传重组分析

如图6所示，利用SimPlot 3.5.1和RDP 4.36对IBV分离株的S1基因进行遗传重组分析发现，毒株CK/CH/HN/NY1206/2017与CK/CH/HN/XY911/2017均存在序列交叉，提示可能有重组事件发生。由表2可知，CK/CH/HN/NY1206/2017与CK/CH/HN/XY911/2017均是由基因型为4/91(CHⅡ)的IBV毒株JP/Saitama/2006和LZ07在S1基因处发生重组而产生的新毒株。CK/CH/HN/XY911/2017核苷酸序列796—1 340 nt与推测的亲本毒株LZ07高度同源，相似性达98.9%，其他S1基因核苷酸序列与推测的亲本毒株JP/Saitama/2006相似性达91.8%，RDP 4.36软件分析计算的P值为8.534×10-14。CK/CH/HN/NY1206/2017核苷酸序列797—1 339 nt与推测的亲本毒株LZ07高度同源，相似性达98.9%，其他S1基因核苷酸序列与推测的亲本毒株JP/Saitama/2006相似性达92.4%，RDP 4.36软件分析计算的P值为1.312×10-14。

图6 SimPlot 3.5.1软件检测IBV分离株的S1基因遗传重组结果Fig.6 Results of detecting recombinant S1 gene of IBV isolates by SimPlot 3.5.1 software

StrainGenotype/nt Break pointsBeginEndMajor parentStrainGenotype/%SimilarityMinor parentStrainGenotype/%SimilarityPP valueCK/CH/HN/XY911/20174/91(CHⅡ)7961 340JP/Saitama/20064/91(CHⅡ)91.8LZ074/91(CHⅡ)98.98.534×10-14CK/CH/HN/NY1206/20174/91(CHⅡ)7971 339JP/Saitama/20064/91(CHⅡ)92.4LZ074/91(CHⅡ)98.91.312×10-14

3 结论与讨论

IB是一种对家禽养殖业具有重要影响且全球分布的传染性疾病。苗立中[20]对山东地区分离的48株IBV进行鉴定，结果显示，有46株属于CHⅠ(QX)基因型，2株属于Mass基因型，表明CHⅠ(QX)基因型已成为山东地区IBV流行的优势基因型。XU等[4]研究发现，近年来，TW Ⅰ型病毒在中国的流行呈上升趋势，除此之外，GI-19型和常用的4/91(CHⅡ)型疫苗之间发生了重组事件，从而产生了不同的IBV分离株。

本研究参照LI等[19]建立的分型方法，基于S1基因的遗传进化树进行分型，得到3株IBV分离株CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/AY119/2018，它们均属于4/91(CHⅡ)基因型。其中IBV分离株CK/CH/HN/NY1206/2017与CK/CH/HN/XY911/2017核苷酸及推导出的氨基酸同源性较高，可能与地理位置距离较近有关。有研究表明，4/91(CHⅡ)基因型毒株主要具有4个裂解位点(RRFRR、RRSRR、RRLRR、HRFRR)[19]，本研究中IBV分离株CK/CH/HN/NY1206/2017与CK/CH/HN/XY911/2017基因裂解位点为RRSRR，CK/CH/HN/AY119/2018为RRFRR，裂解位点并未产生新的突变。

推测本研究中IBV分离株CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017为发生S1基因遗传重组的毒株，通过SimPlot 3.5.1和RDP 4.36软件对分离株进行基因遗传重组分析，发现上述2株分离毒株均是由4/91(CHⅡ)基因型毒株LZ07和JP/Saitama/2006重组产生的新毒株。目前，我国鸡场使用的IBV免疫疫苗主要有Mass型(H120、H52、W93和Ma5)和LDT3型[13]。本研究中，IBV毒株CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/NY1206/2017与使用的Mass型常规疫苗H120和H52株的核苷酸和氨基酸同源性最低，仅为78.3%～78.4%和74.8%～75.4%，与4/91(CHⅡ)型疫苗4/91株的核苷酸和氨基酸同源性较高，达到94.7%～99.3%和93.9%～98.1%。本研究表明，河南省致蛋鸡产蛋下降的IBV流行基因型相对统一，使用4/91(CHⅡ)型疫苗应可提高蛋鸡抗IBV的保护率。但是由于IBV极易发生基因变异和重组，因此，持续性分子流行病学监控对防控IB具有重要的意义。